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Identificación y análisis funcional de nuevos oncogenes amplificados en cáncer de pulmón

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Universitat de Barcelona. Facultat de Biologia

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[spa] El análisis de la expresión global y de número de copias de DNA en tumores primarios y líneas celulares de cáncer de pulmón reveló la presencia de amplificación génica en los cromosomas 11q12, 13q34 y 6p22. En los cromosomas 11q12 y 13q34 se identificaron ocho y tres genes sobre‐expresados, respectivamente; globalmente, la expresión de los transcritos del amplicón 13q34 era bastante superior a la del amplicón 11q12. Debido a su función biológica y a su relevancia en otros tipos de cáncer se seleccionaron los genes CTNND1 y TFDP1, en los cromosomas 11q12 y 13q34 respectivamente, para estudios posteriores. Estudiamos los niveles de expresión de CTNND1 y TFDP1 mediante inmunohistoquímica en tumores primarios de cáncer de pulmón no microcítico. El 1,4% y 2,7% de los tumores, todos de tipo escamoso, presentaron los niveles más altos de expresión de p120ctn y DP1 codificadas, por los genes CTNND1 y TFDP1 respectivamente. El 10% de los tumores tenían una localización citosólica aberrante de p120ctn. Por otra parte, el gen CTNND1 codifica diferentes isoformas de p120ctn por splicing alternativo. En general, los tumores están enriquecidos en la isoforma 3 de p120ctn. Se interfirió la expresión de DP1 mediante siRNA y se midió la proliferación celular mediante ensayos de MTT. Se observó que la inhibición de la expresión de DP1 reduce alrededor de un 50% la viabilidad de células con amplificación de TFDP1 mientras que no afecta a las células sin DP1 sobre‐expresado.

El gen SOX4 fue el único sobre‐expresado respecto a tejido pulmonar normal en la línea celular con amplificación en 6p22. El 3,5% de las líneas celulares y el 6% de los tumores primarios tenían sobre‐expresión de SOX4. Se encontró que tanto SOX4 como SOX2 y SOX11 estaban sobre‐expresados específicamente en células de cáncer de pulmón microcítico. Dentro de los tumores de cáncer de pulmón no microcítico, SOX2 y SOX9 estaban sobre‐expresado en carcinomas escamosos respecto a adenocarcinomas y SOX4 presentaba un patrón contrario.

El análisis de mutaciones de SOX4 en cáncer de pulmón reveló dos variantes germinales en tumores primarios de pulmón, una de ellas se trataba de un polimorfismo presente en la población española y una mutación somática que codifica para una proteína truncada. En las líneas celulares se encontraron dos variantes de cambio de aminoácido y una deleción en pauta. La capacidad de transactivación de SOX4 no cambió en las formas no truncadas respecto a la forma salvaje, mientras que la forma truncada estaba incapacitada para activar la transcripción. Mediante un ensayo de cooperación oncogénica con RHOA‐Q63L y HRAS‐G12V se observó que la expresión creciente de la forma salvaje y las formas no truncadas de SOX4 incrementaban significativamente la habilidad oncogénica de RHOA‐Q63L y no afectaba la capacidad transformante de HRAS‐G12V mientras que la forma truncada reducía el número de focos transformantes originados por HRAS‐G12V.

Mediante la depleción de SOX4 se identificaron nuevos genes regulados directa o indirectamente por este factor de transcripción, muchos de ellos relacionados con el desarrollo neural. A su vez, estos genes se sobre‐expresaban tras la expresión ectópica de SOX4 en líneas celulares y en tumores primarios de pulmón con altos niveles de SOX4. Por otro lado, estos genes tenían una expresión reducida en fibroblastos embrionarios de ratones Sox4/. Finalmente, se demostró el reclutamiento de SOX4 en los promotores de los genes MYB, VASH2, TEAD2 y TUBB3 y en la región de control del cluster de PCDHBs. La firma de expresión génica de SOX4 resultó compartir muchas similitudes con la de cáncer de pulmón microcítico, de origen neuroendocrino, por lo que hay una alta implicación de SOX4 en el desarrollo de este tipo de cáncer.

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[eng] The search for novel oncogenes is important because they could be the target of future specific anticancer therapies.

To screen for amplicons, we aligned the gene expression data according to the position of transcripts and searched for clusters of over‐expressed genes. We confirmed the presence of two amplicons, at chromosomes 11q12 and 13q34. The p120ctn and DP1 proteins, encoded by two candidate oncogenes, CTNND1 and TFDP1, at 11q12 and 13q34 amplicons, respectively, showed very strong immunostaining in lung tumours with gene amplification. Depletion of TFDP1 expression by small interference RNA in a lung cancer cell line with TFDP1 amplification and protein over‐expression reduced cell viability by 50%.

Then, we analyzed DNA copy number and mRNA expression levels in lung cancer cell lines and identified the 6p22.3 amplicon. The SOX4 gene was overexpressed in cells with amplification relative to normal cells. SOX4 expression was also stronger in a fraction of lung primary tumours and lung cancer cell lines. We also found variants of SOX4 in lung primary tumours and cancer cell lines, including a somatic mutation that introduced a premature stop codon. Overexpression of the wildtype and of the non‐truncated variants in NIH3T3 cells significantly increased the transforming ability of the weakly oncogenic RHOA‐Q63L.

Ablating SOX4 expression in SOX4‐amplified lung cancer cells revealed a gene expression signature that included genes involved in neuronal development such as PCDHB, MYB, RBP1 and TEAD2. Interestingly, we found that small cell lung cancer was generally characterized by high levels of SOX2, SOX4 and SOX11 along with the SOX4‐specific gene expression signature identified.

In conclusion, we report the identification of three novel amplicons, at 13q34, 11q12 and 6p22.3. TFDP1 is a candidate oncogene at 13q34. Within the 6p22 amplicon, SOX4 is overexpressed in lung cancer and we provide evidence of its oncogenic properties. We also identify a functional role for SOX genes and several SOX4 novel targets in SCLC.

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Identificación y análisis funcional de nuevos oncogenes amplificados en cáncer de pulmón