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Caracterización funcional de la vía Wnt/Bcatenina en el restablecimiento y mantenimiento del eje anteroposterior durante la regeneración y homeostasis de la planaria Schmidtea mediterranea

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Universitat de Barcelona. Departament de Genètica

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La gran mayoría de planarias son capaces de regenerar, y cuando lo hacen, invariablemente mantienen la polaridad de regeneración; es decir, siempre regeneran una cabeza en las heridas anteriores y una cola en las posteriores al ser amputadas transversalmente. Entender los mecanismos que subyacen dicho fenómeno ha sido objeto de investigación desde finales del siglo XIX. Asimismo, muchos investigadores se han interesado en comprender como una planaria mantiene las proporciones corporales durante la homeostasis, ya que estos organismos experimentan cambios continuos de tamaño. Con la ayuda del genoma secuenciado de la planaria de agua dulce Schmidtea mediterranea y de varios métodos de análisis genéticos (ARN de interferencia, inmunohistoquímica, etc), en esta tesis doctoral he abordado estas cuestiones desde una perspectiva molecular. En concreto, he caracterizado el papel de la vía Wnt/βcatenina en la regeneración y homeostasis del eje antero-posterior (AP) de la planaria S. mediterranea; puesto que durante el desarrollo embrionario de la mayoría de animales estudiados, así como durante la regeneración de cnidarios, esta vía establece el eje primario del cuerpo. Con el fin de analizar las consecuencias de una perdida de función de la vía Wnt/βcatenina en planarias, durante el primer tramo de la tesis doctoral he caracterizado dos parálogos de la βcatenina (Smed-βcatenina-1 y Smed-βcatenina-2). La βcatenina es una proteína típicamente bifuncional implicada en transducir la señal Wnt al núcleo y en mediar las uniones adherentes a la membrana celular. Sin embargo, el análisis de las secuencias aminoacídicas de Smed-βcatenina-1 y Smed-βcatenina-2, junto con los experimentos de ARNi en planarias y de sobreexpresión heteróloga en embriones de Xenopus, sugieren que los dos parálogos de S. mediterránea se han subfuncionalizado en dos proteínas monofuncionales que retienen solo una de estas dos funciones características. Notablemente, Smed- βcatenina-1, pero no la Smed- βcatenina-2, tiene conservada la función de transducir la señal Wnt y su pérdida de función en planarias resulta en la regeneración de una cabeza en vez de una cola (fenotipo two-headed) y en una anteriorización progresiva durante la homeostasis. En el segundo tramo de la tesis doctoral he analizado las consecuencias de una activación ectópica de la vía Wnt/βcatenina en planarias. A tal fin, he caracterizado dos parálogos de la Axina (Smed-axinA y Smed-axinB), puesto que este componente de la vía Wnt es un regulador negativo intracelular muy conservado a lo largo de la filogenia animal. Los experimentos de ARNi simple o conjunta sugieren que Smed-axinA y Smed-axinB actúan de manera sinérgica en planarias regulando negativamente la Smed-βcatenina-1. Así, la pérdida de función de ambas axinas resulta en un fenotipo two-tailed y el triple ARNi contra las axinas y Smed-βcatenina-1 resulta en un fenotipo two-headed. De manera interesante, la formación de una cola ectópica en heridas anteriores no inhibe la regeneración inicial del cerebro en la interfase blastema-postblastema; es más, muchos de los heteromorfos two-tailed con el transcurso del tiempo diferencian otro primordio de cerebro justo al lado de la faringe normal. En conjunto, los datos obtenidos en esta tesis demuestran que la vía Wnt/βcatenina es esencial para restablecer y mantener todas las estructuras del eje AP durante el desarrollo post-embrionario de la planaria S. mediterranea. Además, ponen de manifiesto que en un contexto posteriorizado, existen mecanismos que siguen instruyendo la diferenciación de un primordio de cerebro en el tejido preexistente de manera auto-reguladora. Estos resultados han sido publicados en dos revistas de impacto internacional (Iglesias et al., Development 2008; Iglesias et al., Developmental Biology 2011) contribuyendo significativamente al campo de la regeneración y al de la biología del desarrollo en general.

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The main objective of my thesis has been to characterize the role of Wnt/βcatenin pathway in anterior-posterior (AP) axis re-establishment and maintenance during planarian regeneration and tissue homeostasis. To address this issue, I characterized two βcatenin homologs in the planarian Schmidtea mediterranea, Smed-βcatenin-1 and Smed-βcatenin-2. Loss of function of Smed-βcatenin-1, but not Smed-βcatenin-2, in both regenerating and intact planarians, generates two-headed planarians that evolve to a radial-like hypercephalized phenotype in which the AP axis disappears but the DV axis remains unaffected. This anteriorized phenotype supports a conserved role for canonical Wnt signalling in AP axis specification, whereas the role of βcatenin in DV axis establishment would be a vertebrate innovation. When considered alongside the protein domains present in each Smed-βcatenin and the results of functional assays in Xenopus embryos demonstrating nuclear accumulation and axis induction with Smed-βcatenin-1, but not Smed-βcatenin-2, these data suggest that Smed-βcatenins could be functionally specialized and that only Smed-βcatenin-1 is involved in Wnt signalling (Iglesias et al. 2008). In a second set of experiments, I showed that 2-tailed planarians formed after loss-of-function of Smed-axinA/B (well known negative regulators of the Wnt/βcatenin signalling) but form a brain anlage at their anterior wound site. This shows that mechanisms underlying early brain regeneration can be uncoupled from the re-establishment of AP identity mediated by Wnt/βcatenin pathway in planarians. Interestingly, these brain primordia do not grow and develop into a well-elaborated brain illustrating a specific role of the Wnt/βcatenin pathway in later brain morphogenesis. The two-tailed phenotype eventually differentiate another brain primordia next to the normal pharynx and forms two opposed body axes composed of tail, pharynx and brain primordium tissues as a remodelling response (Iglesias et al. 2011). Taken together, these data shows that Wnt/βcatenin pathway is essential to re-establish and maintain the AP axis during planarian post-embryonic development.

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Tesis Doctorals - Departament - Genètica

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Caracterización funcional de la vía Wnt/Bcatenina en el restablecimiento y mantenimiento del eje anteroposterior durante la regeneración y homeostasis de la planaria Schmidtea mediterranea