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Developmental toxicity screening in the zebrafish embryo – a metabolomics approach

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Universitat de Barcelona. Departament de Farmacologia, Toxicologia i Química Terapèutica

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[eng] Birth defects occur in about 3-6% of human births worldwide (CDC, 2023). To mitigate the risk to the unborn child, the assessment of embryo-fetal developmental toxicity is an integral part of chemical registration and regulation. This currently requires testing on mammals, which raises ethical concerns, is costly and time-consuming. The zebrafish embryotoxicity test (ZET) has been proposed as an alternative approach to developmental toxicity assessment. However, the ZET is not widely accepted by regulatory authorities as the relevance of morphological findings from zebrafish embryo (ZFE) to humans is questioned. Thus, mechanistic endpoints are included as these are more conserved between vertebrate species and could improve interspecies transferability. Metabolome analysis has proven to be a valuable tool to reveal molecular changes indicative of various toxicity mechanisms. The main objective of this thesis was to evaluate the use of metabolome analysis in ZFE for the assessment of developmental toxicity. Two mechanisms of developmental toxicity, thyroid hormone disruption and antiangiogenesis, were examined through exposure of ZFEs to corresponding model substances. A targeted metabolomics approach measuring pooled ZFEs exposed to 6-propyl-2-thiouracil (PTU) was adopted for the initial study on thyroid hormone disruption. In the second study two specific inhibitors of angiogenesis, SU4312 and sorafenib, and two developmental toxicants, methotrexate, and rotenone, with a presumed antiangiogenic mode of action (MoA) were investigated. An untargeted metabolomics approach was employed to overcome the limitations of the previous study. This enabled the analysis of metabolome changes in the individual embryo and the optimization of metabolite coverage. The initial study demonstrated two main aspects: (i) reproducibility of the metabolome response in ZFE, and (ii) correlations between metabolite changes, the MoA of PTU and developmental toxicity. In the second study, 247 concordant metabolite changes were identified between SU4312, sorafenib, and methotrexate. Among the common changes were references to disturbed metabolic pathways of antiangiogenesis and developmental toxicity. Furthermore, 183 joint effects of methotrexate and rotenone suggested a common MoA related to disturbances in energy metabolism. Both studies support the use of metabolome analysis in ZFE for the assessment of developmental toxicity.

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[spa] Los productos químicos y farmacéuticos desempeñan un papel vital en la sociedad moderna; sin embargo, su uso puede suponer un riesgo para la salud medioambiental y humana (Kalter, 2003). Para mitigar este riesgo, la aprobación de sustancias está sujeta a normativas estrictas que estipulan una serie de pruebas toxicológicas, incluida la evaluación de la toxicidad para el desarrollo embrionario y fetal.
La evaluación reglamentaria del riesgo de toxicidad para el desarrollo embrionario y fetal se basa en datos de animales de experimentación, lo que plantea problemas éticos y es altamente costoso (Meigs et al., 2018). Estos factores se ven amplificados por nuevas regulaciones las cuales requieren altas cantidades de datos y resultan en un aumento en el número de ensayos con animales (Hartung, 2009; Regulation (EC) No 1907/2006 - REACH). Por lo tanto, el desarrollo de alternativas parala experimentación animal, también conocidas como NAM (new approach methodologies), está fuertemente impulsado por las demandas sociales, políticas y económicas. Además, las NAM pueden potenciar la evaluación de riesgo para el ser humano al proporcionar información sobre el mecanismo de toxicidad (Otto et al., 2023). Hasta la fecha, la evaluación de toxicidad para el desarrollo embrionario y fetal se ha basado principalmente en los cambios morfológicos apicales, que pueden variar entre especies (Vargesson, 2015), lo que dificulta la extrapolación a los seres humanos. Los cambios moleculares que preceden a la manifestación fenotípica se basan en vías de señalización conservadas de la embriogénesis de vertebrados. Las NAM que incorporan cambios moleculares como criterios de valoración mecanicistas podrían ayudar a superar estas limitaciones en la transferencia entre especies, a la vez, son éticamente responsables y económicas.
El embrión del pez cebra, Danio rerio (ZFE), representa un modelo alternativo ideal para estudiar las interconexiones entre las alteraciones moleculares y la toxicidad para el desarrollo. Según la legislación vigente, durante la nutrición endotrófica, los embriones del pe cebra (ZFEs) están excluidos de la normativa de bienestar animal, por lo que se consideran un modelo de sustitución (Directive 2010/63/EU; Russell & Burch, 1960). Aparte de las ventajas prácticas, como la gran progenie, el fácil manejo, el pequeño tamaño y el rápido crecimiento, el ZFE es también un modelo holístico y, por tanto, conserva las interacciones entre los diferentes tipos celulares. Además, Danio rerio, como los humanos, es vertebrado y, por lo tanto, comparten importantes vías de señalización de la embriogénesis (Artavanis-Tsakonas et al., 1999; NRC, 2000; Zinski et al., 2018).
Las técnicas ómicas capturan una plétora de criterios de valoración moleculares en una sola muestra, lo que permite una evaluación exhaustiva de las vías bioquímicas. A nivel molecular, los cambios en los metabolitos endógenos pueden considerarse dentro de los efectos finales luego de la exposición a una sustancia y, por lo tanto, podrían ser indicativos de adversidad (Taylor et al., 2018). Mientras que los ensayos convencionales de embriotoxicidad del Danio rerio se han centrado en criterios de valoración morfológicos apicales que no siempre se traducen exactamente a la situación in vivo de los mamíferos, los estudios mecanísticos pueden contribuir a una evaluación integral del riesgo.
El objetivo principal de esta tesis fue evaluar el uso del análisis del metaboloma en ZFE para la evaluación de la toxicidad para el desarrollo. Los objetivos secundarios fueron analizar dos mecanismos de toxicidad para el desarrollo, a saber, la alteración de la hormona tiroidea y la antiangiogénesis. Adicionalmente, se optimizará el análisis del metaboloma en ZFE, pasando de un enfoque dirigido a uno no dirigido, con el fin
de investigar embriones individuales en lugar de embriones agrupados, y establecer un flujo de trabajo para procesar datos metabolómicos no dirigidos de ZFEs, con el fin de lograr una cobertura más amplia de metabolitos que puedan utilizarse para la interpretación biológica.
En la presente investigación, se examinaron dos mecanismos de toxicidad para el desarrollo: I) la alteración de la hormona tiroidea y II) la antiangiogénesis, mediante la exposición de los ZFEs a las correspondientes sustancias modelo. Para el estudio inicial sobre la alteración de la hormona tiroidea se adoptó un enfoque metabolómico dirigido midiendo un conjunto de ZFEs expuestos a 6-propil-2-tiouracilo (PTU). En el segundo estudio se investigaron dos inhibidores específicos de la angiogénesis, SU4312 y sorafenib, y dos tóxicos para el desarrollo, metotrexato y rotenona, con un presunto modo de acción (MoA) antiangiogénico. Posteriormente, se empleó un enfoque metabolómico no dirigido para superar las limitaciones del estudio anterior, lo que permitió el análisis de los cambios del metaboloma en el embrión individual y la optimización de la cobertura de metabolitos.
La primera publicación lograda durante esta investigacón (Wilhelmi et al., 2023) "A metabolomics approach to reveal the mechanism of developmental toxicity in zebrafish embryos exposed to 6-propyl-2-thiouracil" demostró la capacidad de respuesta del metaboloma ZFE para indicar la toxicidad para el desarrollo relacionada con alteraciones en la tiroides. Los ZFEs se expusieron a cinco concentraciones de PTU, y se aplicó la metabolómica dirigida para medir más de 200 metabolitos endógenos en muestras de 50 ZFE agrupadas en dos experimentos independientes. La robustez del enfoque ZFE-metabolómica se demostró mediante efectos reproducibles y dependientes de la concentración en los análisis multivariantes (análisis de componentes principales) y univariantes (cambios en las concentraciones relativas de metabolitos). Para identificar los cambios específicos de metabolitos relacionados con el tratamiento, se aplicaron dos métodos. Ambos métodos se basaron en el modelado de una relación concentración-respuesta y en la determinación de un punto de partida (PoD). Mientras que para el primer método se utilizó la respuesta del metaboloma completo para calcular el PoD, el segundo método calculó el PoD a nivel de metabolito individual. A pesar de los diferentes métodos, se encontró un gran solapamiento entre los conjuntos de metabolitos arrojados por el análisis. 19 de los 25 metabolitos arrojados por el segundo método también se encontraron en el conjunto encontrado por el primer método. Entre ellos se encontraban el ácido pipecólico, la tirosina, las lisofosfatidilcolinas y la metionina, que se asociaron con la toxicidad para el neurodesarrollo. Los cambios morfológicos observados en los ojos reforzaron la relevancia de los cambios moleculares para la toxicidad del desarrollo y sirvieron como anclaje fenotípico. Además, el MoA primario del PTU pudo recrearse a partir de la respuesta del metaboloma de la ZFE. Un análisis de vías metabólicas reveló que la biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano fueron las rutas más fuertemente afectada. La PTU inhibe la enzima Yoduro peroxidase (TPO), que cataliza el acoplamiento de los residuos de tirosina para formar las hormonas tiroideas. En consecuencia, la tirosina es un precursor directo de las hormonas tiroideas y la vía afectada sugiere el MoA de PTU. Este estudio demostró que el análisis del metaboloma dirigido en ZFE es adecuado para la investigación de la toxicidad en el desarrollo y puede proporcionar información sobre el MoA. Como factores limitantes para este enfoque, se identificaron el número restringido de metabolitos y la medición de muestras agrupadas, ya que los efectos relevantes pueden diluirse si se producen sólo en un subconjunto de los ZFE.
La segunda publicación (Wilhelmi et al., 2024) "Molecular signatures of angiogenesis inhibitors: a single-embryo untargeted metabolomics approach in zebrafish" identificó un patrón de efecto metabólico común de SU4312, sorafenib y metotrexato con vínculos con la antiangiogénesis y la toxicidad para el desarrollo. En esta investigación, se expuso los ZFEs a dos inhibidores específicos de la angiogénesis (SU4312 y sorafenib) y a dos tóxicos para el desarrollo con supuesta acción antiangiogénica (metotrexato y rotenona). El análisis del metaboloma no dirigido se realizó en embriones individuales. Se observó que la respuesta del metaboloma de los ZFEs con morfología anormal difería de la de aquellas sin cambios morfológicos brutos. En cuanto a la respuesta del metaboloma de los ZFEs tratados con SU4312, sorafenib y metotrexato, se detectó un conjunto de 247 metabolitos que cambiaron de forma concordante. Entre ellos, se observó un aumento de los fosfatidilinositoles y los triglicéridos, así como una disminución de las fosfatidilserinas, los ésteres de colesterol, los ácidos grasos, las purinas, las pterinas y el retinol en relación con la antiangiogénesis y la toxicidad para el desarrollo. En el caso de la rotenona, no se encontró ninguna concordancia significativa con la respuesta del metaboloma de los inhibidores de la angiogénesis. Sin embargo, se observaron 183 cambios metabólicos comunes a la rotenona y el metotrexato, probablemente relacionados con alteraciones del metabolismo energético. Los cambios metabólicos comunes de SU4312, sorafenib y metotrexato pueden considerarse candidatos a biomarcadores para la discriminacón de la toxicidad del desarrollo relacionada con la antiangiogénesis. Sin embargo, es necesario examinar su especificidad analizando otros mecanismos de toxicidad para el desarrollo.
Con el fin de ampliar la cobertura de metabolitos para la interpretación biológica, se compiló un flujo de trabajo para el procesamiento de datos metabolómicos no dirigidos. El preprocesamiento dio lugar a 32.477 características LC-MS, que se redujeron a 1.835 mediante el posterior filtrado y procesamiento fino. Utilizando diferentes propiedades de las características, como la masa, el tiempo de retención y los espectros MS/MS (espectrometría de masas en tandem), se pudo anotar el 82% de las características restantes. Esto multiplicó por cinco el número de metabolitos en comparación con el enfoque específico (Wilhelmi et al., 2023). Además, este enfoque no dirigido permitió la caracterización de la respuesta del metaboloma de ZFE individuales, lo que es crucial en el contexto de la toxicidad del desarrollo, ya que la atención se centra en el individuo y no en la población.
El principal objetivo de esta tesis fue evaluar el uso del análisis del metaboloma en ZFE para la evaluación de la toxicidad para el desarrollo. Tanto el enfoque dirigido como el no dirigido han demostrado que los cambios metabolómicos en ZFEs proporcionan evidencia crucial de alteraciones moleculares asociadas con la toxicidad del desarrollo. Además, se demostró que la respuesta del metaboloma de los ZFEs es reproducible y que pueden derivarse efectos específicos de la sustancia y del MoA. En consecuencia, puede valorarse positivamente el uso del análisis del metaboloma en ZFE para la evaluación de la toxicidad para el desarrollo. Sin embargo, el número de sustancias modelo ensayadas fue limitado. Se necesitan más estudios para determinar la especificidad de las respuestas del metaboloma para la alteración de la hormona tiroidea, la antiangiogénesis y la toxicidad para el desarrollo. Por tanto, el presente trabajo puede considerarse un primer paso hacia el desarrollo de una nueva NAM.
Los otros objetivos se refirieron a la optimización del análisis del metaboloma en ZFE. Esto se consiguió cambiando de un análisis del metaboloma dirigido a uno no dirigido. El enfoque no dirigido permitió la medición de las alteraciones metabólicas en el ZFE individual, que es de particular valor con respecto a la toxicidad del desarrollo, ya que la atención se centra en el individuo. Paralelamente, la cobertura de
metabolitos se multiplicó por cinco. Sin embargo, la confianza en las anotaciones de metabolitos se ha revelado como la principal limitación del análisis no dirigido. Por lo tanto, es concebible que el enfoque no dirigido pueda utilizarse principalmente para explorar biomarcadores de diferentes mecanismos de toxicidad para el desarrollo. El enfoque dirigido podría utilizarse para validar estos biomarcadores e integrarlos en una estrategia de ensayo con fines reguladores. Por tanto, una combinación de ambos enfoques podría acompañar el camino desde el enfoque ZFE-metabolómica hacia una nueva NAM.
El enfoque ZFE-metabolómica proporciona información molecular de alta dimensión de todo un organismo vertebrado a pequeña escala y no se considera un experimento con animales. Esto ofrece importantes conocimientos sobre los mecanismos de toxicidad. Mientras que los métodos in vitro convencionales se centran en criterios de valoración apicales únicos que no siempre se trasladan bien a la situación in vivo, los estudios mecanísticos pueden contribuir a una evaluación de riesgos exhaustiva. Por lo tanto, la incorporación de criterios de valoración mecanísticos, derivados por ejemplo de la metabolómica, en modelos alternativos como el ZFE es un paso fundamental hacia ensayos de toxicidad para el desarrollo no basados en mamíferos.

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Tesis Doctorals - Departament - Farmacologia, Toxicologia i Química Terapèutica

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Developmental toxicity screening in the zebrafish embryo – a metabolomics approach