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Caracterización bioquímica y estructural de la chaperona DnaK de Mycoplasma genitalium

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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[spa]   	
Mycoplasma genitalium es un patógeno humano considerado uno de los organismos autorreplicativos más pequeños que existen. Su genoma fue completamente secuenciado en 1995, y actualmente, se ha convertido en un intenso objeto de estudio porque ha sido descrito como modelo ideal de célula mínima. M. genitalium presenta una morfología celular caracterizada por una extensión de la membrana en uno de los polos de la célula, conocido como Organela Terminal (OT). La OT está involucrada en procesos celulares tales como adhesión, división celular y motilidad con implicaciones directas en patogenicidad y virulencia. La chaperona molecular DnaK forma parte de uno de los sistemas procariotas de chaperonas (DnaK-DnaJ-GrpE) más estudiados pero su mecanismo alostérico aún no ha sido completamente esclarecido. Se resolvió la estructura cristalina de DnaK de un constructo al que le faltan los últimos 74 residuos del C-terminal, por difracción de rayos-X a una resolución de unos 2 Å. Este constructo contiene un dominio de unión a nucleótido y un dominio de unión a sustrato unidos entre sí por un enlazador muy flexible. En la estructura de DnaK el NBD se encuentra unido a un cofactor (ADP o AMP-PNP) y el SBD a un péptido que mimetiza un sustrato sin plegar, esta estructura corresponde a una conformación cerrada. Para estudiar desde un punto de vista estructural el mecanismo alostérico de DnaK, se determinó la estructura tridimensional del NBD en su forma apo, en presencia de AMP-PNP, ATP o ADP. La comparación de estas estructuras indicó que los cambios estructurales consecuencia de la hidrólisis de nucleótido son sutiles. Sin embargo, se apreciaron diferencias importantes en la coordinación del ión magnesio, que es imprescindible en el mecanismo de hidrólisis del nucleótido. Se estudiaron las interacciones de DnaK con sus posibles co-chaperonas (MG200 y MG019) y el factor intercambiador de nucleótido GrpE, tanto por la técnica de Resonancia Superficial por Plasmón como por cromatografía de gel filtración. No se detectó ninguna interacción entre DnaK y sus posibles co-chaperonas, debido a que las condiciones experimentales en las que se realizó el ensayo no fueron las idóneas. Se detectó una fuerte interacción entre DnaK y GrpE. La estequiometria de este complejo fue determinada por MALS y fue confirmada por Espectrometría de Masas Nativa y corresponde a una molécula de DnaK para dos de GrpE (1:2). Se estudió tanto este complejo como sus variantes por la técnica de difracción de rayos-X a bajo ángulo acoplada a una columna de gel filtración. Esta técnica permitió obtener modelos a baja resolución de los componentes del complejo MgNBD y MgDnaKΔCt y de MgGrpE. La estructura en solución de MgNBD es un dominio rígido y globular idéntico a su forma cristalina. MgDnaKΔCt presenta una conformación cerrada en solución que equivale a la conformación encontrada en el cristal, aunque existen variaciones en la orientación espacial entre los subdominios NBD y SBD. Este resultado refuerza la posible existencia de un paso intermedio extra en el modelo alostérico de DnaK propuesto hasta el momento. El modelo a baja resolución de MgGrpE fue validado por un modelo teórico tri-dimensional de MgGrpE puesto que las estructuras de otras GrpEs resueltas hasta el momento no se ajustaban al modelo en solución. Este modelo teórico de GrpE muestra una elevada flexibilidad de los dominios α-hélice de las dos subunidades que componen el dímero siendo el N-terminal de la proteína desestructurado pero con tendencia a formar estructuras helicales lo que parece confirmar la posibilidad de que el N-terminal desestructurado interaccione con el subdominio SBD de MgDnaKΔCt mientras se efectúa el intercambio de nucleótidos en el subdominio NBD MgDnaKΔCt.

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[eng]  	
The human pathogen Mycoplasma genitalium, one of the smallest self-replicating microorganisms, is characterized by the presence of a unique cytoskeleton protrusion called the Terminal Organelle (TO) which is known to be involved in key cellular processes such as cell division, adhesion to host cells, motility and virulence. The structure of the TO is composed by three main parts: the terminal button (distal with respect to the cell body), the electrodense core and the wheel complex (proximal with respect to the cell body. We have characterized the chaperone DnaK system from M. genitalium and investigated its possible role in the formation and functioning of the TO. Here we present the X-ray crystal structures, at about 2 Å resolution, of a construct of DnaK including the Nucleotide and the Substrate Binding Domains (respectively, NBD and SBD) bound to a putative substrate and to the nucleotidic co-factors ADP or AMP-PNP. Moreover, we also present the structures of NBD, at about 1.5 Å resolution, in its apo form and in complex with ADP, ATP or AMP-PNP, which helped to better understand nucleotide hydrolysis. Surface Plasmon Resonance (SPR), and Small Angle X-ray Scattering (SAXS) coupled to HPLC (a relatively new and powerful variant of the technique) allowed, respectively, to detect the interaction between DnaK and the nucleotide exchange factor GrpE and to model DnaK in solution alone and in complex with GrpE.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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Caracterización bioquímica y estructural de la chaperona DnaK de Mycoplasma genitalium