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SMAD6 and ERK Signaling in Vascular Homeostasis: Diagnostic and Therapeutic Implications for Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia

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Universitat de Barcelona. Facultat de Medicina i Ciències de la Salut

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[eng] Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HHT) is a rare genetic disorder characterized by vascular malformations, including visceral arteriovenous malformations and mucocutaneous telangiectasia. It is typically caused by autosomal dominant mutations leading to haploinsufficiency of the ALK1 signaling pathway, which plays a critical role in angiogenesis. As no curative treatment for HHT currently exists, this doctoral thesis aims to investigate ERK signaling as a potential molecular therapeutic target. Preliminary data suggest significant crosstalk between the ALK1 and ERK pathways; however, the molecular mechanisms involved remain largely unexplored.
In parallel, recent genetic studies have identified SMAD6 as a novel candidate gene in patients lacking mutations in the classical HHT-associated genes. Supporting this, in vivo studies have shown that SMAD6 deficiency can result in vascular malformations. As SMAD6 functions as an inhibitor of the ALK1 pathway, these findings introduce a new hypothesis: both upregulation and downregulation of ALK1 signaling can disrupt vascular function, leading to an HHT-like phenotype. Thus, a secondary aim of this thesis is to provide further insights into HHT diagnosis by evaluating vascular function in the context of SMAD6 loss.
Using HHT mouse models, this work demonstrates that ERK signaling is overactivated in the setting of ALK1 haploinsufficiency, and that MEK inhibitors can significantly ameliorate disease symptoms. In vitro studies in HUVECs revealed that RAF1 acts as the upstream target of ALK1 in regulating the ERK pathway, and that the phosphatase PP1 is involved in this mechanism. Furthermore, SMAD6-deficient endothelial cells exhibit ALK1 pathway overactivation, resulting in impaired migration due to enhanced AKT inhibition via PHLPP1 overexpression. SMAD6 loss also impairs NOTCH signaling, leading to reduced expression of arterial specification genes such as EFNB2, increased endothelial proliferation via ERK upregulation, and heightened sensitivity to fluid shear stress through KLF2 and KLF4 overexpression. These changes collectively contribute to defective arterialization.
In conclusion, this doctoral thesis demonstrates that ALK1 signaling homeostasis is essential for proper vascular function. Both positive and negative dysregulation of this pathway can result in HHT-like vascular abnormalities, with ERK overactivation emerging as a shared pathological feature. Therefore, ERK signaling represents a promising new therapeutic target for the treatment of HHT.

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[cat] La Telangièctasia Hemorràgica Hereditària (HHT) és una malaltia genètica rara caracteritzada per malformacions vasculars, incloent-hi malformacions arteriovenoses viscerals i telangièctasies mucocutànies. Normalment és causada per mutacions autosòmiques dominants que condueixen a una haploinsuficiència de la via de senyalització ALK1, la qual és essencial per a una angiogènesi adequada. Dades preliminars apunten a una interacció important entre les vies ALK1 i ERK, tot i que els mecanismes moleculars implicats encara són poc coneguts. Atès que actualment no existeix un tractament curatiu per a la HHT, aquesta tesi doctoral té com a objectiu investigar la senyalització ERK com una possible diana terapèutica molecular. Paral·lelament, estudis genètics recents han identificat SMAD6 com a gen candidat en pacients sense mutacions en els gens clàssicament associats a la HHT. Aquest fet es veu reforçat per estudis in vivo que han demostrat que la deficiència de SMAD6 pot provocar malformacions vasculars. Com que SMAD6 actua com a inhibidor de la via ALK1, aquests descobriments introdueixen una nova hipòtesi: tant una sobreactivació com una disminució excessiva de la via ALK1 poden alterar la funció vascular i donar lloc a un fenotip similar a la HHT. Per tant, un segon objectiu d’aquesta tesi és aportar nous coneixements sobre el diagnòstic de la HHT mitjançant l’estudi de la funció vascular en el context de la pèrdua de SMAD6. Mitjançant models murins d’HHT, aquest treball demostra que la senyalització ERK es troba sobreactivada en un context d’haploinsuficiència de ALK1, i que els inhibidors de MEK poden millorar significativament els símptomes de la malaltia. Els estudis in vitro amb HUVECs van revelar que RAF1 es l’efector més amunt de la via de ERK regulat per ALK1, i que la fosfatasa PP1 participa en aquesta regulació de la senyalització de ERK. A més, les cèl·lules endotelials deficients en SMAD6 presenten una sobreactivació de la via ALK1, la qual provoca alteracions en la migració cel·lular degudes a una inhibició exacerbada de la AKT mitjançant la sobreexpressió de PHLPP1. La manca de SMAD6 també altera la senyalització NOTCH, reduint l’expressió de gens d’especificació arterial com EFNB2, augmentant la proliferació endotelial per mitjà de la via ERK i incrementant la resposta al fluix sanguini a través de la sobreexpressió de KLF2 i KLF4. Aquests canvis contribueixen de manera conjunta a una arterialització defectuosa. En conclusió, aquesta tesi doctoral demostra que la homeòstasi de la via de senyalització ALK1 és essencial per a una funció vascular correcta. Tant la disfunció positiva com la negativa d’aquesta via poden provocar anomalies vasculars compatibles amb el fenotip HHT, i la sobreactivació de la via ERK n’és un tret comú destacat. Per tant, la senyalització ERK representa una nova i prometedora diana terapèutica per al tractament de la HHT.

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[spa] La Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT) es una enfermedad genética rara caracterizada por malformaciones vasculares, incluyendo malformaciones arteriovenosas viscerales y telangiectasias mucocutáneas. Suele estar causada por mutaciones autosómicas dominantes que provocan haploinsuficiencia en la vía de señalización de ALK1, la cual es esencial para una angiogénesis adecuada. Datos preliminares señalan una interacción importante entre las vías de ALK1 y ERK; sin embargo, los mecanismos implicados siguen sin estar bien definidos. Dado que actualmente no existe un tratamiento curativo para la HHT, esta tesis doctoral tiene como objetivo estudiar la vía de señalización ERK como una posible diana terapéutica molecular. Por otro lado, un estudio genético reciente llevado a cabo en pacientes sin mutaciones en los genes clásicos identificó a SMAD6 como un nuevo posible causante de la HHT. Esta hipótesis se ve respaldada por estudios in vivo que han reportado malformaciones vasculares en ausencia de SMAD6. Dado que SMAD6 actúa como un inhibidor de la vía ALK1, surge una nueva hipótesis según la cual tanto una activación excesiva como una disminución de esta vía pueden provocar disfunciones vasculares compatibles con el fenotipo HHT. En consecuencia, esta tesis también busca aportar nuevos conocimientos sobre el diagnóstico de la enfermedad a través del estudio de la función vascular en este contexto. Modelos murinos de HHT demostraron que la vía ERK se encuentra sobreactivada en situaciones de haploinsuficiencia de ALK1, y que los inhibidores de MEK son capaces de mejorar los síntomas de la enfermedad. Además, estudios in vitro en HUVECs revelaron que RAF1 es el objetivo más aguas arriba de la vía de ERK regulado por ALK1, y que la fosfatasa PP1 participa en esta regulación de la señalización de ERK. Asimismo, estudios in vitro mostraron que las células endoteliales sin SMAD6 presentan una sobreactivación de la vía ALK1 que provoca alteraciones en la migración celular debidas a una inhibición exacerbada de AKT, mediada por la sobreexpresión de PHLPP1. Además, la ausencia de SMAD6 compromete la señalización de NOTCH, reduciendo la expresión de genes arteriales como EFNB2 y aumentando la proliferación celular por activación de ERK. También incrementa la respuesta al flujo sanguíneo a través de la sobreexpresión de KLF2 y KLF4, contribuyendo a una arterialización defectuosa. Como conclusión general de esta tesis doctoral, se demuestra que la homeostasis de la vía de señalización ALK1 es esencial para el correcto funcionamiento vascular. Tanto su activación como su inhibición pueden dar lugar a un fenotipo compatible con HHT, siendo la sobreactivación de la vía ERK un rasgo común en ambos escenarios. Por tanto, la señalización ERK se presenta como una nueva y prometedora diana terapéutica para el tratamiento de la HHT.

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Tesis Doctorals - Facultat - Medicina i Ciències de la Salut

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SMAD6 and ERK Signaling in Vascular Homeostasis: Diagnostic and Therapeutic Implications for Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia