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Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en las propiedades anticancerosas y antimetastásicas de las prodigininas. Identificación de mTOR como diana molecular en células de melanoma

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Universitat de Barcelona. Departament de Patologia i Terapèutica Experimental

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[spa] El melanoma metastásico es un modelo de tumor especialmente agresivo y resistente a inmuno, radio y quimioterapia. La pobre prognosis de los pacientes y el preocupante incremento de casos en los últimos años hacen necesario el diseño y desarrollo de nuevos y mejorados agentes anticancerígenos, así como nuevas estrategias más eficaces. 

Las células de melanoma presentan alteraciones genéticas y moleculares que alteran el control de la proliferación y supervivencia celular. Estas alteraciones permiten superar las barreras de control del crecimiento y migración celular, aspectos asociados no sólo con la inmortalización y adquisición de las propiedades invasivas, sino que también les confieren resistencia frente a tratamientos quimioterapéuticos. 
Tanto la vía PI3K/AKT/mTOR, como la vía mitogénica mediada por MAPKs, son claves en la supervivencia y crecimiento celular. Ambas vías, a través de GSK-3 se encuentran implicadas en la sobreexpresión de proteínas anti-apoptóticas de la familia BCL-2. La sobreexpresión de esta familia de proteínas facilita que la célula escape a los mecanismos apoptóticos inducidos por agentes citotóxicos convencionales. Por esta razón, estrategias terapéuticas basadas en la inhibición de estas vías han mostrado su potencial en estudios clínicos. Este potencial radica en la activación simultánea de dos mecanismos de muerte celular: apoptosis y autofagia.

De entre la familia de compuestos anticancerosos conocidos como prodigininas (PGs), en un principio, prodigiosina destacó por su marcado efecto pro-apoptótico en diferentes líneas tumorales. Actualmente, un derivado sintético de las PGs, obatoclax, que fue diseñado como molécula BH3 mimética, está siendo evaluado en ensayos clínicos en fase III. Sin embargo, los estudios realizados en melanoma muestran la modesta eficacia de obatoclax como agente individual, lo que hacía necesario estudios más exhaustivos sobre los mecanismos de acción de esta molécula. Un efecto citotóxico más marcado se ha obtenido mediante el tratamiento con prodigiosina. A pesar de que ambas moléculas han mostrado desencadenar similares mecanismos moleculares, las diferencias estructurales entre ambas moléculas serían críticas en su actividad. Los nuevos datos aportados contribuyen a un mejor entendimiento de los eventos moleculares que desencadenan la actividad anticancerosa y antimetastásica de las PGs. En este aspecto, la caracterización de PGs como inhibidores duales de mTORC1 y mTORC2 pone en evidencia la relevancia que estas moléculas podrían tener en un futuro en la terapia contra el cáncer. La interacción de PGs al centro activo de mTOR se confirmó mediante técnicas de resonancia de plasmón superficial (SPR), monitorizando las interacciones a tiempo real, usando biosensores ópticos. Los parámetros cinéticos y de afinidad mostraron que ambas moléculas forman complejos estables, específicos, y de alta afinidad a concentraciones nanomolares. Los ensayos de competición con ATP revelaron que no existe competición entre ATP y las PGs por su lugar de unión, sugiriendo que las PGs actúan como inhibidores ATP no miméticos. 
	
Un valor añadido de estas moléculas son sus probadas propiedades antimetastásicas. En este aspecto, demostramos que la inhibición de mTOR promueve la desestabilización del complejo ILK/rictor con la consecuente pérdida de señalización a través de la vía de las integrinas, crítica para el movimiento celular. Observamos que, todo ello conlleva a la desorganización del citoesqueleto, pérdida de los contactos focales y pérdida de la capacidad migratoria de las células. 
	
Finalmente, estrategias análogas fueron utilizadas para llevar a cabo estudios de relación estructura-actividad de las PGs. La estructura tripirrólica de prodigiosina (PG) contiene grupos amino y metoxi comunes en obatoclax (OBX) relacionados con su actividad citotóxica. El bloqueo de estos grupos mediante la adición del grupo aniónico F2B resultó en la pérdida de actividad de esta molécula. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de estos grupos en la actividad de PGs, y aportan nuevos datos para el diseño de nuevos derivados sintéticos más efectivos y menos tóxicos.

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[eng] MECHANISMS OF ACTION INVOLVED IN THE ANTICANCER AND ANTIMETASTATIC PROPERTIES OF PRODIGININES. 
Identification of mTOR as a molecular target in melanoma cells. 

Because of high chemotherapeutic resistance of metastatic melanoma are necessary new strategies with improved drugs, more effectives with lower toxicity. Anticancer activity of prodiginines has been described in vitro and in vivo in different cancer cell models, including melanoma. Prodiginines are tripyrrolic molecules from bacterial metabolism under pre-clinical and clinical evaluation. 
In this study we have focused our efforts on identified the molecular mechanisms of prodiginines involved in their cytotoxic effects. In melanoma cells, we have observed the activation of both cell death mechanisms: apoptosis and autophagy after prodigiosin treatment. Our results demonstrate that prodigiosin is a BH3-mimetic drug, as it was previously described for obatoclax (GX15-070). Obatoclax is a synthetic prodiginine derivative actually in clinical trials in phase III. Moreover, we have identified mTOR as a new molecular target of prodigiosin and obatoclax. PI3K/AKT/mTOR pathway is involved in cell survival, proliferation and migration. Different cross-talks and feedback loops regulate this pathway and, also, are involved in different compensatory mechanisms that confer chemoresistance to melanoma cells. Dual inhibition of mTORC1 and mTORC2 mediated by both prodiginines disrupted the negative feedback loop S6K/IRS-1. The interaction of both prodiginines in the active site of mTOR was monitorized by Surface Plasmon Resonance (SPR) assays. Nanomolar kinetic and affinity parameters indicated high affinity, stability and specificity of these interactions. Nevertheless, results showed that both prodiginines are not ATP-mimetic drugs. In silico models showed the detailed atomic view of the complexes indicating the critical residues involved in these interactions. Moreover, structure-activity relationship (SAR) studies corroborated the importance of pyrrole amino groups in the cytotoxic prodiginines activity mediated by mTOR inhibition. 
Finally, we observed that mTOR inhibition by prodiginines promotes actin filaments desorganization, decrease of focal adhesions and inhibition of cell migration. Our results suggest that prodiginines might inhibit integrin signalling through ILK/rictor complex.  
Alltogether, these results contribute to further understanding the molecular mechanisms of prodiginines and, also, their chemotherapeutical potential. Moreover, we provide new data about their structural properties that will allow the development of more-effective anticancer molecules.

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Tesis Doctorals - Departament - Patologia i Terapèutica Experimental

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Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en las propiedades anticancerosas y antimetastásicas de las prodigininas. Identificación de mTOR como diana molecular en células de melanoma