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Estudio de las proteínas de la partícula regulatoria del proteosoma y del ensamblaje de la lid y análisis estructural del dominio OBD de RepB y su unión al ADN

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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[spa] La presente tesis consta de dos proyectos, que detallo a continuación: - Estudio de las proteínas de la partícula regulatoria del proteosoma y del ensamblaje de la lid El sistema ubiquitina-proteosoma es la mayor ruta proteolítica citosólica en eucariotas, controla casi todos los procesos celulares básicos degradando las proteínas unidas a una cadena de ubiquitinas. El sistema se compone de una cascada de ligasas de ubiquitina que conjugan la ubiquitina a las proteínas diana y el proteosoma responsable de la degradación de dichas proteínas. El proteosoma 26S presente en eucariotas se puede dividir en dos complejos: la partícula central (20S) y la partícula regulatoria (19S), a su vez la partícula regulatoria puedo dividirse en dos subcomplejos: la base y la lid. En este proyecto se realizó el clonaje, expresión heteróloga y purificación de todas las proteínas Rpn de la lid y tres de la base (Rpn1, 2 y 10) de Saccharomyces cerevisiae en Escherichia coli. Las proteínas se expresaron individualmente y en conjunto (mediante la co-expresión y/o co-lisis). Estos experimentos resultaron en una amplia variedad de subcomplejos, desde complejos de dos proteínas hasta cinco y el reemplazo de algunas subunidades por versiones truncadas proporcionó información sobre áreas discretas de interacción entre proteínas, permitiendo crear un modelo de interacciones intermoleculares dentro del complejo de la lid. Además tres de los complejos obtenidos (Rpn5/8/9, Rpn5/8/9/11 y Rpn5/6/8/9/11) se analizaron mediante microscopia electrónica (EM) proporcionando una visión de los eventos biogénicos de la lid, ya que representan la adición consecutiva de subunidades. - Análisis estructural del dominio OBD de RepB y su unión al ADN El plásmido de amplio espectro pMV158 se replica mediante el mecanismo de círculo rodante. Su proteína de iniciación de la replicación es RepB, la cual reconoce y corta el ADN en un sitio específico. En un trabajo previo realizado en nuestro laboratorio se resolvió la estructura tridimensional de esta proteína full length, demostrando su naturaleza hexamérica. Cada monómero de RepB se compone de dos dominios: el OBD (origin-binding domain) responsable del reconocimiento del sitio de corte y el OD (oligomerization domain) que se unen entre si formando el hexámero. En este trabajo se cristalizó y resolvió mediante reemplazo molecular la estructura del OBD de RepB unido a su ADN diana, un oligonucleótido de 23bp que aloja parte de la secuencia del sitio de unión al ADN. La estructura nos permitió analizar la interacción específica proteína/ADN, la cual se establece en el surco mayor, pudiendo identificar los aminoácidos que interaccionan con áreas discretas en el ADN, siendo estos resultados comparables con aquellos descritos con anterioridad en la literatura mediante otras técnicas como mutaciones puntuales o estudios de fingerprinting. A su vez generamos un modelo que explica el modo de acción de RepB a la hora de reconocer el sitio de corte en su condición hexamérica.

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[eng] This PhD thesis is composed of two different projects: •Study of the proteasome regulatory particle proteins and the assembly of the lid complex. The 26S proteasome, the main protein-degradation machine in the eukaryotic cell, is composed of two discrete complexes: core and regulatory particle (RP), which can be sub-divided into the base and lid sub-complexes. By combining biochemical and structural methods, we have analyzed the interactions that hold the RP. Expressing individually or in complex the full length or truncated proteins we were able to construct a detail map of interaction within the lid complex. Three stable subcomplexes of the lid (trimeric, tetrameric and pentameric) have been solved by electron microscopy, providing a vision of lid assembly events, as they represent the consecutive addition of subunits. •Structural analysis of the RepB OBD domain and its DNA interaction. RepB initiates plasmid rolling-circle replication by binding to a triple 11-bp direct repeat (bind locus) and cleaving the DNA at a specific distant site located in a hairpin loop within the nic locus of the origin. This protein acts as a hexameric ring complex, where each protomer has two domains: the origin-binding domain (OBD) and the oligomerization domain (OD). The OBD shows a three-layer a–b–a sandwich fold, the active site is located at one of the faces of the bsheet and coordinates a metal ion at a short distance from the essential nucleophilic Y99. The OBD is also responsible for the recognition of the specific binding sequences. In this work we describe the structural characterization by X-ray crystallography of the OBD bound to its target DNA and we propose a model for the mechanism of action of the hexameric complex.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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Estudio de las proteínas de la partícula regulatoria del proteosoma y del ensamblaje de la lid y análisis estructural del dominio OBD de RepB y su unión al ADN