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P-Glycoprotein functional activity in peripheral blood lymphocytes. Role of immunosuppressants, pharmacogenomics and alloimmune response

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Universitat de Barcelona. Facultat de Medicina

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[spa] En la nefropatía crónica del aloinjerto renal (NCT) se implican factores aloinmunes y no aloinmunes tales como la aloreactividad donante específica, inflamación crónica y nefrotoxicidad inducida por los anticalcineurínicos. La nefrotoxicidad varía en función de la combinación de los inmunosupresores. Así mismo, el diferente grado de nefrotoxicidad podría estar relacionado con el grado de inhibición de las diferentes proteínas transportadoras (MDR1, MRP1 y MRP2) que son las responsables de afluir el fármaco hacia el exterior de las células. Considerando la importancia del papel de éstas proteínas, las diferentes variantes genéticas de los genes que las codifican y su función, pueden afectar a la variabilidad interindividual con sus consecuencias en la farmacocinética de muchos fármacos. La monitorización del genotipo de los genes MDR1, MRP1 y MRP2, así como también su función, podría predecir la dosis óptima de los inmunosupresores en receptores de trasplante renal y la dosis inicial que necesita cada paciente individual para obtener la inmunosupresión adecuada. Los polimorfismos de estos genes están relacionados con la exposición al fármaco, la nefrotoxicidad y el rechazo. Estas proteínas también se asocian a factores inmunológicos. Tanto MDR1 como MRP1 juegan un papel importante en la activación de la célula T y también en la diferenciación y maduración de la célula dendrítica. El papel de estas proteínas transportadoras va más allá de una bomba de extrusión ya que se conoce que participan en la respuesta inmune siendo una nueva diana terapéutica para la inmunosupresión. El principal objetivo fue estudiar el rol de la P-Glicoproteína (MDR1/Pgp) tanto como una bomba transportadora de fármacos como su contribución en la farmacocinética y farmacogenética de los inmunosupresores. También se estudió el rol de Pgp en la respuesta aloinmune. En un primer estudio, se comparó la expresión de Pgp y la actividad de eflujo mediante el ensayo de Rodamina (Rho123) en linfocitos de voluntarios sanos guardados en diferentes condiciones para evaluar la influencia que podían tener estas condiciones de almacenaje sobre la expresión y funcionalidad de Pgp. Se puso a punto un método para la medida de actividad de Pgp en linfocitos T, para poder ser aplicada en muestras de linfocitos de pacientes trasplantados renales. Se aislaron linfocitos de la sangre de 12 voluntarios sanos y se evaluó las diferencias de expresión de Pgp a nivel de RNA y proteína, entre linfocitos procesados y guardados en diferentes condiciones de almacenaje. En un segundo objetivo se analizó la asociación de diferentes polimorfismos (SNPs) de Pgp/ABCB1 (C3435T, C1236T, G2677T i T129C) con la actividad de Pgp y la exposición a diferentes fármacos inmunosupresores en 70 pacientes de trasplante renal de diferentes hospitales. En un estudio in vivo donde se describe un modelo de nefrotoxicidad en ratas, se estudió el papel de Pgp en la asociación de Rapa (mTORi) con dos inhibidores de calcineurina (CsA y Tac). A partir de este trabajo, se realizó el siguiente estudio donde se analizó la actividad de Pgp in vitro en diferentes sub-poblaciones de célula T y los efectos de los mismos inmunosupresores solos y asociados con Rapamicina.

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[eng] Both immunological and non immunological factors are involved in chronic allograft nephropathy such as donor specific alloreactivity, chronic inflammation and nephrotoxicity induced by anticalcineurinics. Different degrees of nephrotoxicity are related to immunosuppression and to the level of inhibition of the different transporter proteins such as MDR1, MRP1 and MRP2. Those proteins could be subjected to genetic inter-individual variability thus modifying pharmacokinetics parameters. Furthermore, optimal immunosuppressive dose could be predicted by genotype characterization of MDR1, MRP1 or MRP2 genes. Polymorphisms in these genes have been related to immunosuppressive exposure, nephrotoxicity and renal allograft rejection. Those proteins have also been associated to immunological factors. Both MDR1 and MRP1 have been involved in T cell activation and also in dendritic cells (DCs) differentiation, migration and maturation. It has been hypothesized that ABC transporter proteins play a major role in drug efflux and also may be an underlying factor as an immunomodulator. Considering that many immunosuppressants are substrates and also inhibitors of this ABC transporter proteins, the hypothesis of this doctoral thesis is to evaluate if Pgp activity would participate in lymphocyte activation and if the polymorphisms of this protein in renal transplant recipients with different immunosuppressive regimen could have a functional role in the pharmacokinetics of the immunosuppressants. The main objective is to study the role of P-glycoprotein as an efflux pump and its contribution in the pharmacokinetics and pharmacogenetics of immunosuppressants. On the other hand, far from the well known role in drug exposition and nephrotoxicity, to improve the knowledge on its function in the alloimmunity responses. In the first study we compared Pgp expression and efflux activity by measuring Rho123 retention in lymphocytes stored under different conditions to evaluate the potential influence of any of the storing conditions on Pgp expression and functionality. To improve Pgp studies, especially multicentric ones, sampling strategies should be considered in order to optimize the sensitivity and reproducibility of efflux assays. There is no data which compares Pgp activity measured from fresh lymphocytes with cryo-preserved lymphocytes. Moreover, most authors do not specify under which conditions cells are preserved and stored before measuring Pgp activity. Here, we isolated lymphocytes from fresh venous blood from 12 healthy volunteers and four storage conditions of lymphocytes were used. 1) Fresh lymphocytes (Fresh/Non-frozen) (F/NFr); 2) Lymphocytes frozen immediately after the extraction (Fresh/Frozen) (F/Fr); 3) Lymphocytes isolated within 24 hours after the extraction (Non-fresh/Non-frozen) (NF/NFr); 4) And lymphocytes isolated within 24 hours after the extraction and immediately frozen (Non-fresh/Frozen) (NF/Fr). The objective of the second study was to investigate the association of different ABCB1 polymorphisms (C3435T, G2677T, C1236T and T129C) with Pgp activity and exposure of different immunosuppressive drugs in renal transplant patients from eight different centers. This substudy of pharmacogenomics was part of the Symphony study. The main objective of the Symphony trail was to establish the differences on MPA and its metabolites exposure among the four immunosuppressive groups: MMF in combination with normal or low doses of CsA, low doses of Tac and low doses of SRL. The study was evaluated in seventy patients: CsA (n=30), tacrolimus (n=13) and sirolimus (n=23). For the pharmacokinetic analysis, the AUC0-12 of all immunosuppressants was compared at each time along the follow-up. For this purpose, 11 blood samples were collected for each point: before the first MMF administration of the day and up to 12h post-dose. To perform the study, patients were genotyped for SNPs in ABCB1 gene and moreover, Pgp activity was evaluated in PBMCs using the Rho123 efflux assay. Considering earlier studies in our group which describes the in vivo impact of the association of Rapa (mTORi) with two calcineurin inhibitors (CsA and Tac) on Pgp function and the involvement of Pgp in this immunosupressor-related renal toxicity, in the next study, we analyzed the activity of Pgp on different T-cell subsets and we studied the effects of the same immunosuppressants in monotherapy and associated with rapamycin. Rho123 uptake, efflux and kinetic of extrusion in CD4+ and CD8+ subsets of peripheral blood mononuclear cells isolated from eight healthy volunteers were measured. We also studied the antigen-specific memory T-cell responses by measuring T-cell proliferation and cytokine secretion using an allogeneic mixed lymphocyte reaction.

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P-Glycoprotein functional activity in peripheral blood lymphocytes. Role of immunosuppressants, pharmacogenomics and alloimmune response