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Rol de la microbiota en pacientes con bronquiectasias no asociadas a la fibrosis quística

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Universitat de Barcelona. Departament de Genètica, Microbiologia i Estadística

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[spa] El pulmón siempre se ha considerado estéril. Sin embargo, el campo de la microbiota pulmonar se ha visto revolucionado por el avance de las técnicas moleculares. Cada individuo tiene un perfil de microbiota único, definido como el conjunto de microorganismos presentes en un ambiente establecido, que ha coevolucionado con el huésped y coloniza sus tejidos mucosos, formando una relación mutualista y simbiótica. El término microbioma se utiliza para describir todo el hábitat, que incluye los microorganismos, sus genomas y las condiciones ambientales circundantes.
La microbiota pulmonar es escasa, crece en un ambiente pobre en nutrientes y está en constante renovación, debido a la función pulmonar (tos, aclaramiento mucociliar, mecanismo de defensa del huésped) y la migración desde el tracto respiratorio superior y la dispersión de la mucosa. Además, la edad, la genética y el entorno contribuyen a la variabilidad individual y la constante evolución a lo largo de la vida. Los principales filos en pulmones sanos son Proteobacteria, Firmicutes y Bacteroidetes, mientras que a nivel de género predominan Streptococcus, Prevotella y Veillonella, esta última con menor contribución en el desarrollo, progresión y agudizaciones de las enfermedades pulmonares. De hecho, la estructura alterada del pulmón, el curso de la enfermedad y los tratamientos crónicos pueden desencadenar cambios en la microbiota pulmonar, lo que lleva a desequilibrios en la comunidad microbiana, también conocida como disbiosis.
En este trabajo se ha estudiado en primer lugar cual era la combinación de regiones hypervariables del gen 16S rRNA ribosomal (V1V2, V3V4, V5V7, V7V9) con mayor sensibilidad y especificidad respecto a la identificación taxonómica en muestras de esputo. Se utilizó un control estándar de microbiota comercial para validar los resultados. Nuestro estudio confirma que cada región hipervariable 16S rRNA proporciona diferencias significativas en la identificación taxonómica en el esputo. En particular, nuestros resultados sugieren que V1V2 en lugar de V3V4 exhibe un mayor poder de resolución para la identificación de taxonomía. Por lo tanto, las plataformas de secuenciación de tercera generación de 16S rRNA de longitud completa están más disponibles y mejoran las tasas de error, V1V2 se puede usar para la identificación taxonómica en el esputo. El hallazgo puede permitir en futuros trabajos de microbiota
 
respiratoria utilizar las regiones adecuadas para evitar sesgos en la información taxonómica resultante de estos.
Una vez obtenida esta aproximación metodológica se ha demostrado que la alta carga bacteriana de P. aeruginosa se asocia con la aparición de un patobioma. Los resultados demuestran una asociación significativa entre la presencia de una alta carga de P. aeruginosa y la disminución de la diversidad, abundancia y variabilidad de la flora concomitante, posicionando la agrupación de la carga de P. aeruginosa como un biomarcador microbiano potencial en pacientes con bronquiectasias. Estos hallazgos brindan la base para extrapolar el estado del microbioma según la carga de P. aeruginosa mediante cultivos estándares en la rutina de la microbiología clínica y comprender mejor la gravedad del paciente no tan solo según el patógeno sino según la disbiosis que comporta el patógeno per se. Una vez encontrado este patobioma según la carga bacteriana de P. aeruginosa en la etapa final de este estudio se hipotetizó si clusterizando por fenotipo de P. aeruginosa (mucoide y no mucoide) encontraríamos el establecimiento de un patobioma. El fenotipo mucoide es típico de los biofilms bacterianos y se asocia a la colonización crónica. Los hallazgos fueron exitosos en relación con la hipótesis dado que, según el fenotipo, así como según la carga bacteriana anteriormente demostrada, se encontró un patobioma en pacientes con el fenotipo mucoide. El presente estudio nos ha permitido encontrar la región hipervariable más resolutiva para muestras de esputo, identificar el patobioma y como consecuencia la gravedad del paciente por la disbiosis provocada por este patiobioma según la carga bacteriana y según el fenotipo de P. aeruginosa.

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[eng] The lung has always been considered sterile. However, the field of lung microbiota has been revolutionized by the advance of molecular techniques. Each individual has a unique microbiota profile, defined as the assemblage of microorganisms present in an established environment, that has coevolved with the host and colonizes its mucosal tissues, forming a mutualistic and symbiotic relationship. The term microbiome is used to describe the entire habitat, that includes the microorganisms, their genomes and the surrounding environmental conditions.
The lung microbiota is scarce, it grows in a nutrient poor environment, and it is in constant turnover, due to pulmonary function (cough, mucociliary clearance, host defense mechanism) and migration from the upper respiratory tract and mucose dispersion. Moreover, the age, genetics and environment contribute to the individual variability and the constant evolution through life. The main phyla in healthy lungs are Proteobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes, while at the genus level Streptococcus, Prevotella and Veillonella predominate, with lesser contributions from Haemophilus and Neisseria. Besides, evidence is growing about the colonization of virus and fungi in the respiratory tract of both healthy and ill individuals. The airway microbiota plays a crucial role in the development, progression and exacerbation of lung diseases. Indeed, the altered structure of the lung, the disease course and the chronic treatments may trigger changes in regional growth conditions, leading to imbalances in the microbial community, also known as dysbiosis.
In this work, we have studied, in the first place, which was the combination of hypervariable regions of the bacterial ribosomal 16S rRNA that allows a greater power of taxonomic identification with respect to the others in sputum samples. Our study confirms that each 16S rRNA hypervariable region provides significant differences in taxonomic identification.. Notably, our results suggest that V1V2 rather than V3V4 exhibits higher resolving power for sputum taxonomy identification. Therefore, meanwhile, full-length 16S rRNA third-generation sequencing platforms become more widely available and improve error rates, V1V2 can be used for taxonomic identification in sputum as it has the most resolving power. high among the other hypervariables regions.
 
The finding may allow future respiratory microbiota studies to use the appropriate regions to avoid bias in the resulting taxonomic information.
Once this methodological finding was obtained, it has been shown that the high bacterial load of P. aeruginosa is associated with the appearance of a pathobiome. The results demonstrate a significant association between the presence of a high P. aeruginosa load and decreased diversity, abundance, and variability of the concomitant flora, positioning
P. aeruginosa load clustering as a potential microbial biomarker in patients with bronchiectasis. These findings provide the basis to extrapolate the state of the microbiome according to P. aeruginosa load using standard cultures in routine clinical microbiology and to better understand the severity of the patient not only according to the pathogen but also according to the dysbiosis caused by the pathogen per se. Once this pathobiome was found according to the bacterial load of P. aeruginosa in the final stage of this study, it was hypothesized whether, by culturing by P. aeruginosa phenotype (mucoid and non- mucoid), we would find the establishment of a pathobiome. The findings were successful in relation to the hypothesis since according to the phenotype, as well as according to the previously demonstrated bacterial load, a pathobiome was found in patients with the mucoid phenotype. The present study has allowed us to find the most resolving hypervariable region for sputum samples, identify the pathobiome and, consequently, the severity of the patient due to the dysbiosis caused by this patiobiome according to the P. aeruginosa load and according to the P. aeruginosa phenotype.

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Tesis Doctorals - Departament - Genètica, Microbiologia i Estadística

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Rol de la microbiota en pacientes con bronquiectasias no asociadas a la fibrosis quística