# name
Control of the expression of key genes to spare protein and increase the use of dietary carbohydrates in gilthead sea bream (Sparus aurata)

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Almajano Pablos, Ma. Pilar (María Pilar)

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Fisiologia

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[eng] Aquaculture raises several concerns about environmental welfare and sustainability. To increase the current knowledge of the control of glucose homeostasis in carnivorous fish, we studied the effect of metformin, an anti-diabetic drug for humans, on serum metabolites, and ratelimiting enzymes in key pathways and lipogenic factors in the liver of gilthead sea bream (Sparus aurata). Our findings showed that metformin improved glucose homeostasis in S. aurata by counteracting glucose-dependent activation on key enzymes in glycolysis and the citric acid cycle, and the expression of lipogenic factors. In addition to advance in the characterization of the intermediary metabolism of a carnivorous and glucose intolerant fish, the results of this study suggest that metformin reduced gluconeogenesis by decreasing hepatic transdeamination and amino acid entrance into the citric acid cycle and their subsequent use as gluconeogenic substrates. To induce a protein-sparing effect in S. aurata by boosting conversion of carbohydrates into lipids, an additional aim of this thesis was to study the effect of chitosan-TPP nanoparticles complexed with a plasmid expressing the N-terminus of hamster SREBP1a (pSG5-SREBP1a) by periodical intraperitoneal injection (every 4 weeks; 3 doses in total) to S. aurata fed diets differing in macronutrient composition. Following 70 days of treatment, chitosan-TPP-pSG5-SREBP1a nanoparticles hugely upregulated SREBP1a mRNA levels in the liver of S. aurata. Consistent with improved conversion of dietary carbohydrates into lipids, overexpression of SREBP1a in the liver increased serum triglycerides and cholesterol as well as hepatic glucose oxidation via glycolysis and the pentose phosphate pathway, while not affecting gluconeogenesis and transamination. Furthermore, upregulation of SREBP1a significantly increased weight gain, specific growth rate and protein efficiency ratio, while decreased feed conversion ratio even in fish fed a low protein-high carbohydrate diet. In addition to show that chitosan-TPP-DNA nanoparticles constitute an efficient method to express exogenous genes in fish avoiding the use of genetically modified organisms, the results of this study support that periodical administration of chitosan-TPP-DNA nanoparticles to overexpress SREBP1a in the liver enhanced growth performance of S. aurata through a mechanism that enabled protein sparing by enhancing metabolization of dietary carbohydrates in a carnivorous glucose intolerant fish.

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[spa] La acuicultura produce beneficios innegables, como el suministro de alimentos accesibles y de buena calidad para las poblaciones y la generación de millones de puestos de trabajo relacionados. Sin embargo, la piscicultura plantea importantes retos relacionados con el bienestar ambiental y la sostenibilidad. La harina de pescado es la principal fuente de proteínas en los alimentos acuícolas, especialmente en el caso de los peces carnívoros, debido a su alto contenido de proteínas, perfil adecuado de aminoácidos, alta palatabilidad, falta de antinutrientes y presencia de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Dado que una proporción significativa de las capturas de peces silvestres se procesa en harina de pescado para alimentos acuícolas, cualquier esfuerzo que permitiera reducir el contenido proteico en los alimentos acuícolas aliviaría la dependencia de los caladeros pesqueros, que a menudo están sobreexplotados. Además, el exceso de proteínas en los piensos acuícolas aumenta la oxidación de aminoácidos, la liberación de amoníaco y la eutrofización de los ecosistemas receptores de efluentes. Por lo tanto, la sustitución, al menos de manera parcial, de la harina de pescado y las proteínas de la dieta por nutrientes más baratos con un impacto ambiental reducido constituye un importante reto a afrontar para reducir el impacto ambiental de la piscicultura y promover una acuicultura más sostenible. Sin embargo, las características metabólicas de los peces, particularmente los carnívoros, limitan la sustitución de las proteínas de la dieta por otros nutrientes en los piensos acuícolas. La mayoría de las especies de peces cultivadas en Europa, como la dorada (Sparus aurata), son especies carnívoras ectotérmicas. Los peces carnívoros utilizan eficientemente los aminoácidos para crecer y obtener energía. Sin embargo, los peces carnívoros presentan una marcada intolerancia a la glucosa. Los carbohidratos de la dieta se metabolizan más lentamente que en los mamíferos y dan lugar a una hiperglucemia prolongada y un crecimiento deficiente. A pesar del interés comercial de la producción de peces carnívoros, los mecanismos moleculares que regulan el metabolismo intermediario siguen siendo en gran medida desconocidos en estas especies. Para aumentar el conocimiento actual sobre el control de la homeostasis de la glucosa en peces carnívoros, hemos estudiado el efecto de la metformina, un fármaco antidiabético ampliamente utilizado en humanos, sobre los niveles de metabolitos séricos, la expresión de enzimas reguladoras de vías metabólicas clave y factores lipogénicos en el hígado de S. aurata. Nuestros hallazgos mostraron que la metformina mejoró la homeostasis de la glucosa en S. aurata al contrarrestar la activación dependiente de glucosa de enzimas clave en la glucólisis y el ciclo del ácido cítrico, así como la expresión de factores lipogénicos. Además de avanzar en la caracterización del metabolismo intermediario en peces carnívoros e intolerantes a la glucosa, los resultados de este estudio sugirieron que la metformina reducía el flujo gluconeogénico a través de un mecanismo que implicaba una disminución de la transdesaminación hepática y de la entrada de aminoácidos en el ciclo del ácido cítrico y su posterior utilización como sustratos gluconeogénicos. Anteriormente demostramos que la administración de una dosis de nanopartículas de quitosanotripolifosfato (TPP) complejadas con un plásmido que expresaba el dominio activo N-terminal de SREBP1a de hámster, causó un efecto multigénico en el hígado de S. aurata 72 horas después del tratamiento, permitiendo la conversión de carbohidratos en lípidos al mejorar la expresión de enzimas clave en la glucólisis, síntesis de colesterol y síntesis, elongación y desaturación de ácidos grasos. En esta tesis, nos planteamos la hipótesis de que la expresión sostenida a largo plazo del dominio activo N-terminal de SREBP1a de hámster en el hígado podría inducir un fuerte efecto ahorro de proteínas en S. aurata y, eventualmente, afectar al crecimiento. Por lo tanto, un objetivo adicional de esta tesis fue estudiar el efecto de las nanopartículas de quitosano-TPP complejadas con un plásmido que expresa el extremo N-terminal de SREBP1a de hámster (pSG5-SREBP1a) mediante inyecciones intraperitoneales periódicas (cada 4 semanas; 3 dosis en total) a S. aurata alimentados con dietas que difieren en la composición de macronutrientes. Tras 70 días de tratamiento, las nanopartículas de quitosano-TPP-pSG5-SREBP1a promovieron un fuerte incremento de los niveles de RNAm de SREBP1a en el hígado de S. aurata. De acuerdo con un incremento en la conversión de los carbohidratos de la dieta en lípidos, la sobreexpresión de SREBP1a en el hígado aumentó los niveles séricos de triglicéridos y colesterol, así como la oxidación hepática de glucosa a través de la glucólisis y la vía de las pentosas fosfato, sin afectar la gluconeogénesis ni la transaminación. Además, la sobreexpresión de SREBP1a aumentó significativamente la ganancia de peso, la tasa de crecimiento específico y el índice de eficiencia proteica, mientras que disminuyó el índice de conversión de alimento, incluso en peces alimentados con una dieta baja en proteínas y alta en carbohidratos. Además de demostrar que las nanopartículas de quitosano-TPP-DNA constituyen un método eficiente para expresar genes exógenos en peces sin utilizar organismos genéticamente modificados, los resultados de este estudio indican que la administración periódica de nanopartículas de quitosano-TPP-DNA para sobreexpresar SREBP1a en el hígado mejora el crecimiento de S. aurata a través de un mecanismo que permite ahorrar proteínas al mejorar la metabolización de los carbohidratos de la dieta en un pez carnívoro intolerante a la glucosa.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Fisiologia

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Control of the expression of key genes to spare protein and increase the use of dietary carbohydrates in gilthead sea bream (Sparus aurata)