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Receptores nucleares implicados en la regulación endocrina en "Blatella Germanica" (L) (Dyctioptera, Blattellidae). Caracterización de los genes BgEcR-A, BgHR3 y BgFTZ-F1

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Universitat de Barcelona. Departament de Fisiologia (Biologia)

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[spa] En los insectos, las diferentes transiciones que se producen a lo largo del desarrollo, tanto embrionario como post-embrionario, se encuentran reguladas por pulsos de ecdisteroides, en particular por la 20 hidroxiecdisona (20E). Esta señal se transduce mediante factores de transcripción de la família de los receptores nucleares, en concreto, la 20E se une al heterodímero formado por el receptor de la ecdisona (EcR) y el producto del gen ultraespiraculo (USP) y, una vez unida, activa una pequeña serie de genes tempranos, que, a su vez, amplifican esta señal mediante la inducción de los denominados genes tardíos que controlan la respuesta biológica a la hormona. Dentro de esta cascada génica, cabe destacar el eje funcional formado por los receptores nucleares EcR-HR3-FTZ F1 el cual interviene en la coordinación de las mudas larvarias, así como en el inicio de la metamorfosis en Drosophila melanogaster. Es importante subrayar que no se conoce si la jerarquía de factores nucleares inducidos por la 20E también existe y opera en insectos más primitivos con un desarrollo hemimetábolo como es nuestro insecto modelo Blattella germanica. En la presente tesis doctoral iniciamos la caracterización del eje funcional EcR-HR3-FTZ F1 en el dictióptero Blattella germanica. Así pues, hemos llevado a cabo el clonaje de los ortólogos de los receptores nucleares HR3 y FTZ-F1 en B. germanica obteniendo tres isoformas de HR3 (BgHR3 A, BgHR3 B1 y BgHR3 B2) y dos de FTZ F1 (BgFTZ F1A y BgFTZ F1B). Hemos caracterizado los patrones de expresión de estos transcritos y del receptor de la ecdisona (BgEcR A), que se había clonado previamente en nuestro laboratorio, en las dos últimas fases ninfales así como durante la embriogénesis de B. germanica. Además, analizamos el papel regulador que estos receptores nucleares desempeñan durante el desarrollo ninfal de B. germanica, y especialmente en el proceso de la muda. Para ello, hemos utilizado la técnica del RNA de interferencia (RNAi) in vivo  mediada por la inyección intraabdominal de RNAs de doble cadena (dsRNA) de cada uno de los genes a estudiar. Cuando estos dsRNAs eran inyectados en hembras recién emergidas a sexto estadio ninfal, la mayoría de las ninfas interferidas no eran capaces de completar la écdisis  y morían transcurridas 24-48 h. El análisis fenotípico de estos individuos mostró que presentaban duplicación de las estructuras de origen ectodérmico y que presentaban alteraciones en los niveles de ecdisteroides hemolinfáticos. No obstante, un cierto porcentaje de las ninfas tratadas con dsBgEcR A y dsBgFTZ F1 eran capaces de completar la muda imaginal, esto nos permitió estudiar procesos que se ven afectados por estos dos factores de transcripción durante la vida adulta. Los individuos interferidos con dsBgEcR A que mudaban a adulto presentaban claros defectos en la extensión de los dos pares de alas, por su parte, las ninfas tratadas con dsBgFTZ F1 también presentaban alas mal posicionadas, aunque correctamente extendidas. El segundo fenotipo observado en todos los individuos tratados con dsBgEcR A y dsBgFTZ F1 que mudaban a adulto es que la glándula protorácica no degeneraba. Ampliamos el análisis funcional de cada uno de los receptores nucleares que estamos analizando, BgEcR A, BgHR3 y BgFTZ F1 al periodo embrionario de B. germanica. El análisis de los embriones interferidos para BgEcR A y BgFTZ F1 mostró que estos individuos progresaron hasta las 48 h de desarrollo embrionario, presentando, sin embargo, considerables malformaciones que impidieron su posterior desarrollo. Mientras que aquellos que eran silenciados para BgHR3, que fueron capaces de progresar hasta las 96 h de desarrollo, presentaron defectos en el desarrollo de la región cefálica, desde un nivel poco severo en el que únicamente se apreció una cierta reducción o pérdida de los lóbulos cefálicos hasta embriones que presentaban la pérdida de todos los segmentos cefálicos.

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[eng] Ecdysteroids control molting in insects. The active form of ecdysteroids, 20 hydroxyecdisone (20E), exerts its function through the activation of a small set of transcription factors. In turn, these genes induce the expression of a larger set of other genes that control the biological response to the hormone. The orphan nuclear receptors EcR, HR3 and FTZ F1 have been shown to act as crucial members of the 20E-regulatory hierarchy in coordinating molting in the holometabolous insects Drosophila melanogaster and Manduca sexta. However, little is known on the role of these factors on primitive insects. Here, we report the cloning and characterization of BgHR3 and BgFTZ F1 in the hemimetabolous species Blattella germanica. Moreover, we use in vivo RNAi mediated by double-strand RNA (dsRNA) treatment to define BgEcR A, BgHR3 and BgFTZ F1 functions during molting in B. germanica. When dsRNAs were injected at the beginning of the last larval instar, treated larvae had normal appearance and movements until the end of the instar. However, by the molting time most of them did not molt, became motionless and became arrested. Phenotypic analysis reveal that treated specimens had two pairs of mouth appendages, double tubular tracheae and produce a new cuticle. Moreover,  the dsBgHR3-treated animals have higher ecdysteroids levels, whereas those of  dsBgEcR A and dsBgFTZ F1-treated are lower than controls. Some of the nymphs treated with dsBgEcR A and dsBgFTZ F1 progressed through a complete molting. Interestingly, these knockdowns showed defects in wing extension and the prothoracic gland did not degenerated. Also, we have studied BgEcR A, BgHR3 and BgFTZ F1 functions during B. germanica embryogenesis.  Using RNAi parental we found that dsBgEcR-A and dsBgFTZ-F1 treated animals progress up to the 12% of development and resulted in germ bands showing severe phenotypes. While, those interfered with dsBgHR3 could progress up to the 25% of development but they shown defects in the cephalic regions which ranged in severity from reduction or loss of cephalic lobes to the complete loss of the cephalic segments.

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Tesis Doctorals - Departament - Fisiologia (Biologia)

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Receptores nucleares implicados en la regulación endocrina en "Blatella Germanica" (L) (Dyctioptera, Blattellidae). Caracterización de los genes BgEcR-A, BgHR3 y BgFTZ-F1