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Análisis de la expresión génica y de los mecanismos de muerte celular inducidos por la bisantraciclina WP631 en células tumorales humanas

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Universitat de Barcelona. Departament de Genètica

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[spa] Nuestro grupo ha participado en el análisis de los mecanismos de acción de la Bisantraciclina WP631. Hemos comparado los efectos de la WP631 con los de la Daunorubicina en la línea Jurkat T (leucemia de linfocitos T), y con los de la Doxorubicina en las líneas MDA-MB-231 y MCF-7/VP (líneas de carcinoma mamario). Hemos demostrado que la WP631 es un agente antiproliferativo mucho más eficaz que la Daunorubicina y la Doxorubicina en las tres líneas tumorales analizadas, ya que inhibe el crecimiento celular a dosis muy reducidas (en el rango de nanomolar).  En este trabajo se han analizado los mecanismos de muerte celular a través de los cuales las Antraciclinas ejercen su efecto antiproliferativo. Hemos demostrado que estas moléculas pueden inducir mecanismos distintos a la apoptosis dependiente de p53: senescencia y catástrofe mitótica, procesos que no dependen necesariamente de la funcionalidad del gen p53. Los efectos antiproliferativos de la Daunorubicina sobre las células leucémicas Jurkat T dependen de la dosis utilizada: apoptosis a dosis altas (IC75) y senescencia a dosis bajas / moderadas (IC50). La WP631 no induce apoptosis en la línea Jurkat T, sino catástrofe mitótica. El efecto antiproliferativo de la Doxorubicina y la WP631 en las líneas de carcinoma mamario MDA-MB-231 y MCF-7/VP, resistentes a la apoptosis, tiene lugar a través de la inducción de catástrofe mitótica. Nuestros resultados demuestran que la catástrofe mitótica se produce cuando las células tumorales resistentes a la apoptosis se tratan con genotóxicos, y puede ser un proceso tanto dependiente como independiente de la activación de la caspasa-2 y la caspasa-3.  Mediante el uso de Macroarrays, hemos demostrado que existe una clara correlación entre las variaciones en los perfiles de transcripción génica y los efectos celulares observados en células Jurkat T tratadas con Daunorubicina o WP631. Confirmamos alguno de los cambios observados mediante RT-PCR semicuantitativa y Western blot. Comprobamos que la WP631 reduce la expresión de p53 en células Jurkat T, resultado que explica que la Bisantraciclina indujera catástrofe mitótica y no apoptosis en esta línea celular. Hemos confirmado que la WP631 compite con los factores de transcripción Sp1 y Sp3, e inhibe la transcripción dependiente de Sp1 in vivo (cultivos celulares), a las mismas concentraciones capaces de inducir la catástrofe mitótica en las células Jurkat T.  Hemos demostrado que la dosis IC75 para la WP631 reduce la transcripción del gen mrp-1 en la línea celular MCF-7/VP, lo que se traduce en la reducción de la actividad de la proteína MRP-1. Este efecto podría estar mediado, también, por la interferencia de la WP631 con el factor de transcripción Sp1, que regula positivamente la expresión del gen. Dado que la sobreexpresión del gen mrp-1 está asociada a la resistencia múltiple a antitumorales, la WP631 es una molécula con interés clínico potencial en el tratamiento de tumores con fenotipo MDR (Multidrug Resistance).  En definitiva, en este trabajo hemos demostrado las ventajas potenciales de la WP631 sobre la Daunorubicina y la Doxorubicina. Estas ventajas radican en sus propiedades de unión al DNA y en su capacidad de desplazar al factor de transcripción Sp1. El análisis de las frecuencias de las dianas potenciales de unión para la WP631 en diferentes promotores humanos, nos indica que es factible diseñar racionalmente moléculas de bajo peso molecular con constantes de unión al DNA del mismo orden de magnitud que la de los factores de transcripción, pudiéndose obtener fármacos cada vez más eficaces. Por otro lado, consideramos que el análisis en profundidad de los mecanismos moleculares que regulan los procesos de senescencia y catástrofe mitótica ha de constituir una herramienta muy útil para poder incrementar la eficacia en determinados tratamientos antitumorales, ya que el gen p53 se encuentra frecuentemente inactivado en tumores de origen no hematológico.

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[eng] WP631 is a DNA-binding drug that bisintercalates into DNA. We have established that WP631 is more cytotoxic than daunorubicin and doxorubicin against Jurkat T lymphocytes and the breast carcinoma MDA-MB-231 and MCF-7/VP cell lines. Exposure of Jurkat T lymphocytes to high concentrations of daunorubicin (its IC75) resulted in immediate apoptosis, while low/moderate concentrations of daunorubicin (its IC50) caused cell senescence-like arrest and cell death. In contrast, WP631 induced mitotic catastrophe in Jurkat T cells, a different mode of death than apoptosis, which does not require functional p53. After treatment with doxorubicin or WP631, MDA-MB-231 and MCF-7/VP cells were committed to die through mitotic catastrophe. Our results indicate that cells dying through mitotic catastrophe can use both caspase-dependent and independent pathways.   We used cDNA Macroarrays to asses gene expression profiles in Jurkat T cells treated with daunorubicin or WP631. Gene expression profiles and time-dependent response of Jurkat T lymphocytes to cell death were correlated clearly. Treating cells with WP631 inhibited the transcription of the p53 gene, resulting in a decrease of the protein levels. Our findings suggest that suppression of the p53 expression produced limited apoptosis and induced mitotic catastrophe in Jurkat T cells treated with WP631. Our results show that WP631, used at the same concentration that induces mitotic catastrophe in Jurkat T cells, specifically inhibits Sp1-dependent transcription in vivo (cell culture).  Overexpression of the MRP-1 protein confers resistance to several chemotherapeutic agents. The mrp-1 promoter contains a Sp1 binding site, which is involved in the regulation of its gene transcription. We aimed to determine whether WP631 directly inhibits the expression of mrp-1 in MCF-7/VP cells. We have demonstrated that when MCF-7/VP cells were incubated with the IC75 for WP631, the expression of the mrp-1 gene decreased, resulting in the circumvention of the drug pump efflux, and cell death.  We have also studied the frequencies with which potential WP631-binding sites are found in human gene promoters. Our results indicate that sequences of 6-8 pb in length occur only once in some promoters, and may be specific therapeutic targets.

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Tesis Doctorals - Departament - Genètica

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Análisis de la expresión génica y de los mecanismos de muerte celular inducidos por la bisantraciclina WP631 en células tumorales humanas