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Mecanismos moleculares que confieren resistencia a la apoptosis por TGF-beta en células de Hepatocarcinoma Celular Humano

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[spa] En los últimos años nuestro grupo ha estudiado las diferentes vías de señalización inducidas por TGF-β en hepatocitos fetales de rata. A dosis bajas, el TGF-β inhibe el crecimiento, pero a concentraciones más elevadas es capaz de inducir apoptosis (Sanchez et al. 1995; Sanchez et al. 1996). El proceso apoptótico está mediado por un incremento en el contenido intracelular de ROS, dependiente de la síntesis de novo de proteínas, y que correlaciona con una caída en los niveles intracelulares de glutatión (Sanchez et al. 1997). La muerte inducida por TGF-β en estas células se correlaciona con un descenso en los niveles de Bcl-xL, la despolarización de la membrana mitocondrial, la salida de citocromo c y posterior activación de caspasas (Herrera et al. 2001a; Herrera et al. 2001b). El incremento de ROS intracelulares se produce por activación de un sistema NADPH oxidasa y por disminución en la expresión de proteínas antioxidantes (Herrera et al. 2004). Recientemente hemos descrito que la NADPH oxidasa NOX4 se induce en condiciones pro-apoptóticas (Carmona-Cuenca et al. 2006), pero otras NADPH oxidasas podrían jugar un papel diferente en la señalización inducida por TGF-β (Murillo et al., 2007). La muerte inducida por TGF-β puede ser inhibida por EGF a través de la activación de PI3K (Fabregat et al. 2000), que contrarresta la expresión de Nox4 (Carmona-Cuenca et al. 2006). Sin embargo, el 40-50% de las células sobreviven a los efectos apoptóticos del TGF-β y adquieren una morfología fibroblastoide (Sanchez et al. 1999). Esto es debido a que el TGF-β también induce señales anti-apoptóticas en los hepatocitos fetales, proceso que requiere la activación del EGFR, producida por un aumento en los niveles de expresión de sus ligandos y activación de la metaloproteasa TACE/ADAM17 que los proteoliza y activa (Valdes et al. 2004; Murillo et al. 2005; Del Castillo et al. 2006; Murillo et al. 2007). Las células que sobreviven al TGF-β responden a esta citoquina en términos de migración e invasión, disminuyendo la expresión de marcadores hepáticos (Sanchez et al. 1999), e induciendo un proceso de EMT (Valdes et al. 2002). La población mesenquimática resultante es resistente a la muerte inducida por TGF-β, ha sufrido un proceso de desdiferenciación y expresa marcadores de célula madre (Del Castillo et al. 2006; del Castillo et al. 2008). Esta población puede rediferenciarse tanto a un linaje hepatocítico como hacia células biliares cuando se mantienen con los medios de diferenciación adecuados. Por último, resultados preliminares al inicio de esta tesis doctoral proponían que la doble respuesta al TGF-β observada en hepatocitos fetales de rata en cultivo primario era exclusiva de este estadio del desarrollo hepático, ya que en hepatocitos adultos de rata el TGF-β sólo inducía apoptosis. La incapacidad del TGF-β de inducir señales de supervivencia parece deberse a la baja expresión de AKT y de TACE observada en hepatocitos adultos. Además, el TGF-β era incapaz de inducir un proceso de EMT en hepatocitos adultos de rata. A la vista de estos resultados se consideró de gran importancia analizar cuál podría ser la respuesta al TGF-β en células tumorales hepáticas. Así, nuestro principal objetivo en esta tesis ha sido analizar si las células de carcinoma hepatocelular responden a la muerte celular inducida por el TGF-β, y en el caso de que hayan adquirido resistencia, estudiar los mecanismos moleculares que la confieren. También queríamos saber si el TGF-β induce señales de supervivencia y un proceso de EMT en células tumorales hepáticas, y la relevancia de este proceso en la progresión del tumor hepático. Aunque quisimos iniciar el estudio con células de hepatoma de rata, debido a nuestra experiencia en este modelo de celular, consideramos muy importante también analizar la situación en células tumorales de hígado humano, ya que es conocido que los niveles de TGF-β son elevados en carcinoma hepatocelular (HCC) y diferentes evidencias han sugerido que la respuesta al TGF-β está alterada en células de HCC.

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[eng] In the last years our research has focused on analyzing the signaling pathways induced by TGF-β in liver tumor cell lines, to understand the molecular mechanisms that confer resistance to its suppressor effects. TGF-β induces apoptosis in human fetal hepatocytes and in some liver tumor cells (FaO rat hepatoma, Hep3B and PLC/PRF/5 human hepatocarcinoma cells), which requires reactive oxygen species (ROS) production and up-regulation of the NADPH oxidase NOX4. This process is coincident with an increased expression of pro-apoptotic BCL-2 family members, such as BMF or BIM. However, in these same cells, TGF-β also induces anti-apoptotic signals, mediated by the activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and coincident with up-regulation of the anti-apoptotic proteins BCL-XL, MCL1 or HIAP1. Inhibition of the EGFR, either by pharmacological inhibitors or through targeting knock-down with specific siRNA, significantly enhances the apoptotic response, which indicates that the EGFR plays a relevant role in conferring resistance to TGF-β-induced cell death. However, even when the EGFR is inhibited, some hepatocellular carcinoma cells, such as HepG2 or SK-Hep1, continue showing resistance to TGF-β-induced cell death. HepG2 cells are sensitized to TGF-β-induced apoptosis through the inhibition of the MEK pathway. MEK inhibition allows TGF-β to induce its pro-apoptotic program in these cells, which is coincident with NOX4 upregulation, modulation of the expression of BCL-2 family members and caspase-3 activation. It is worthy to note that activation of survival pathways, such as EGFR or MEK/ERK, in liver tumor cells confers resistance to TGF-β-induced cell death through impairing NOX4 up-regulation, which is required for an efficient mitochondrial-dependent apoptosis. Finally, our results have indicated that TGF-β is able to induce an epithelial to mesenchymal transition (EMT) process in human fetal hepatocytes, FaO rat hepatoma cells and Hep3B human hepatocarcinoma cells. TGF-β induces Snail expression, coincident with a decrease in E-cadherin mRNA and protein levels. Furthermore, cells show an increased expression of mesenchymal genes and reorganization of the actin cytoskeleton in stress fibers. Interestingly, these cells show loss of expression of specific hepatic markers and increased expression of stem cell markers. Indeed, chronic treatment with TGF-β selects a population of mesenchymal cells with a de-differentiated phenotype, reminiscent of progenitor-like cells. In summary, TGF-β induces different signals in liver tumor cells, some of them might contribute to tumor suppression (apoptosis), but others should mediate liver tumor progression and invasion.

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Tesis Doctorals - Departament - Ciències Fisiològiques II

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Mecanismos moleculares que confieren resistencia a la apoptosis por TGF-beta en células de Hepatocarcinoma Celular Humano