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Estudio de los microRNAs en la fisiopatología de la hepatitis alcohólica

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Universitat de Barcelona. Facultat de Medicina

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[spa] Las enfermedades hepáticas por alcohol son una de las mayores causas de mortalidad y uno de los principales motivos para el  trasplante de hígado en Europa y Norte América. La hepatitis alcohólica (HA) es un episodio agudo que aparece en pacientes con una enfermedad hepática alcohólica. Las formas severas de la HA tienen una mayor mortalidad a corto plazo, además estos pacientes tienen una respuesta insuficiente a los tratamientos actuales. La patofisiología de la HA está caracterizada por: infiltrado de células inflamatorias, daño hepatocelular, esteatosis, fibrosis, reacción ductular y colestasis, aunque mucho aspecto son todavía desconocidos. 
Los microRNAs (miRNAs) son moléculas de RNA no codificantes para proteínas, que tienen aproximadamente 22 nucleótidos. Son reguladores post-transcripcionales de la expresión génica uniéndose al RNA mensajero por complementariedad de secuencia. Son capaces de inhibir la traducción a proteína o de provocar la degradación del RNA mensajero. Cada miRNA es capaz de unirse a varios RNA mensajeros diana, pero a su vez cada RNA mensajero puede estar siendo regulado por diversos miRNAs. La expresión global de miRNAs y de genes es contexto dependiente, siendo diferente en cada tipo celular, tejido o condición fisiológica. Esta ampliamente descrito que existe una desregulación de la expresión de los miRNAs en prácticamente todas las enfermedades en las que se han estudiado. 
El objetivo de esta tesis doctoral era identificar los miRNAs más relevantes en la fisiopatología de la hepatitis alcohólica y evaluar su función. 
Esta tesis doctoral muestra que la HA está caracterizada por un importante cambio en la expresión hepática de los miRNAs. Mediante array de miRNA se analizó la expresión en hígado de pacientes con HA respecto a individuos controles. Se identificaron 117 miRNAs desregulados. Seguidamente se realizó una comparativa del perfil de miRNAs en la HA con los perfiles de otras enfermedades hepáticas crónicas para identificar miRNAs específicamente desregulados en la HA y por tanto potencialmente involucrados en aspectos propios de la fisiopatología de la HA. Hemos identificado 18 miRNAs desregulados específicamente en la HA. A continuación, gracias a un análisis integrativo de la expresión de miRNA y la expresión génica identificamos que los genes potencialmente regulados por los miRNAs están involucrados en el metabolismo y el transporte de los ácidos biliares. 
De entre los miRNAs específicamente desregulados en la HA hemos identificado al miR-182 por su alta expresión en los pacientes con HA y posteriormente mostramos la correlación de su expresión con parámetros clínicos, con índices de severidad de la enfermedad hepática y con una mayor mortalidad. Posteriormente evaluamos la expresión del miR-182 en varios modelos animales que representan características clave de la HA como fibrosis, endotoxemia, inflamación, toxicidad por alcohol o reacción ductular. Nuestros resultados mostraron que el miR-182 está principalmente sobreexpresado en un modelo animal con reacción ductular y colestasis, además de estar principalmente expresado por las células de la reacción ductular. Consecutivamente, se realizó un estudio in vivo de pérdida de función del miR-182 en un modelo de reacción ductular y colestasis. Nuestros resultados revelaron una bajada del contenido hepático de ácidos biliares, una bajada de las transaminasas hepáticas y una menor expresión de genes de mediadores inflamatorios. Por otro lado, se estudiaron in vitro los efectos de una sobreexpresión del miR1-82 en diversos tipos celulares. Este estudio mostró que la sobreexpresión del miR-182 tiene mayor impacto sobre colangiocitos provocando una mayor expresión de mediadores inflamatorios. En cambio los efectos sobre hepatocitos y macrófagos fueron menores. Conjuntamente estos resultados sugieren que el miR-182 está involucrado con el daño colangiolar y la inflamación hepática. 
Seguidamente, se estudió el papel del miR-155, un miRNA ampliamente descrito por su relación con el sistema inmune y las células inflamatorias. La expresión hepática del miR-155 se encuentra sobreexpresada en el hígado de pacientes con HA, así como en el hígado de pacientes con hepatitis autoinmune (HAI). Sorprendentemente encontramos una reducción de la expresión del miR-155 en las células inflamatorias circulantes de los pacientes con HA y con HAI. A continuación, evaluamos el efecto de la deficiencia del miR-155 en dos modelos animales de daño hepático bien diferenciados. En el modelo de intoxicación por paracetamol no observamos cambios significativos en los animales deficientes en el miR-155. En cambio, en un daño por concanavalina los animales deficientes en miR-155 mostraron un mayor nivel de transaminasas hepáticas y mayor expresión de citoquinas proinflamatorias. Además observamos una reducción del reclutamiento de células CD4+CXCR3+, que podrían representar células T reguladoras infiltradas. Consecutivamente realizamos un trasplante de medula ósea capaz de expresar el miR-155 en animales deficientes; estos animales mostraron una reducción de la expresión de los mediadores inflamatorios, así como menor muerte hepatocelular. Todos estos resultados muestran que la restauración de la expresión del miR-155 en las células inflamatorias podría ayudar a aliviar el daño hepático. 
En conclusión, esta tesis doctoral demuestra que existe una desregulación hepática de los miRNAs y que esta desregulación está relacionada con la fisiopatología de la enfermedad, revelando así que los miRNAs son potenciales diana terapéuticas en el tratamiento de las enfermedades hepáticas en general y la HA en particular.

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[eng]  Alcoholic hepatitis (AH) develops in patients with underlying ALD and heavy alcohol intake and has a high short-term mortality. The pathogenesis of AH is still poorly understood; it is characterized by inflammatory cell infiltration, steatosis, fibrosis, ductular reaction expansion and cholestasis.
MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA known to participate in the regulation of important pathophysiological pathways in liver diseases. 
The main aim of this doctoral thesis was to identify the most relevant miRNAs in the pathophysiology of the AH and evaluate its function. 
Our results reveal that in the liver of AH patients there are an important dysregulation in the miRNA expression, as compared to normal liver. In addition, 18 miRNAs were found specifically expressed in AH compared to other chronic liver diseases. Furthermore, functional analysis of the potential target genes of these miRNAs showed its involvement in the metabolism and transport of biliary acids. 
We selected miR-182 since it was the most highly expressed miRNA in AH. The miR-182 showed a positive correlation with severity scores and with short-term mortality. miR-182 is mainly expressed in an animal model of ductular reaction and colestasis; and is mainly expressed in ductular reaction cells. 
In vivo study of loss-of-function of miR-182 shows a decrease in liver damage, bile acid contents and a reduction in the expression of inflammatory mediators. In addition in vitro studies overexpressing the miR-182 showed a high impact in human cholangiocytes. 
Subsequently, we evaluated the role of miR-155, a miRNA widely described to be involved with the immune system. Hepatic expression of miR-155 was found to be overexpressed in AH patients, and also in Autoimmune Hepatitis (AIH) patients. Surprisingly, the expression of miR-155 in circulatory inflammatory cells was underexpressed. 
Next, we evaluated the deficiency of miR-155 in animal models. Concanavalina treatment, a model for AIH, was evaluated. miR-155 deficient animals showed high liver damage and overexpression of inflammatory mediators. Interestingly, these animals had a lower recruitment of CD4+CXCR3+ cells. Subsequently, we restore the expression of miR-155 in the inflammatory cells through bone marrow transplant. We achieved a reduction in the expression of inflammatory genes and hepatocellular damage. Altogether, these results show that restoration of miR-155 on inflammatory cells might alleviate liver damage.  
In conclusion, thesis demonstrates that there is a hepatic dysregulation of the miRNAs and that this deregulation is related to the pathophysiology of the disease, thus revealing that the miRNAs are potential therapeutic targets in the treatment of liver diseases in general and specifically in AH.

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Estudio de los microRNAs en la fisiopatología de la hepatitis alcohólica