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Preparación, estudio estructural y aplicabilidad de derivados de poli-(4R)-hidroxi-L-prolina en la separación de enantiómeros por técnicas cromatográficas y relacionadas

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Universitat de Barcelona. Departament de Farmacologia i Química Terapèutica

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Uno de los mayores retos en cromatografía enantioselectiva consiste en desarrollar fases estacionarias quirales (FEQs) con campos de aplicación extensos que permitan la separación de enantiómeros en cantidades industriales. En general, los selectores quirales poliméricos que adoptan estructuras secundarias helicoidales originan FEQs de aplicación más generalizada. Aunque el aminoácido prolina se ha considerado idóneo para inducir selectividad en procesos de reconocimiento enantioselectivo, las FEQs que lo contienen presentan una aplicabilidad muy reducida. Sin embargo, los péptidos de poliprolina, al igual que los polisacáridos, adoptan conformaciones helicoidales estables, y es imaginable que puedan originar FEQs con campos de aplicación y capacidad de carga más elevados. En la presente Tesis Doctoral se evalúa la adecuación de derivados de poli-(4R)-(3,5- dimetilfenil)aminocarboniloxi-L-prolina como selectores quirales (SQs) para la separación de enantiómeros en HPLC. Para la preparación de los oligómeros de prolina se utiliza un procedimiento de síntesis peptídica en fase sólida (SPPS) de tipo Boc. El sustituyente 3,5- dimetilfenilcarbamato en posición 4R del anillo de pirrolidina se introduce para dotar al selector quiral (SQ) de múltiples sitios de interacción (anillos aromáticos π y grupos polares) con los que participar en el reconocimiento molecular de los enantiómeros. El derivado de poliprolina obtenido se inmoviliza sobre gel de sílice en partículas, y las FEQs se empaquetan en columnas para cromografía. El comportamiento cromatográfico de las nuevas FEQs de poliprolina se analiza y compara frente al que proporcionan FEQs basadas en derivados de prolina análogos. Los ensayos cromatográficos comparativos determinan que los derivados de poliprolina presentan mayor enantioselectividad y un campo de aplicación más extenso, lo que sugiere un mecanismo de reconocimiento quiral distinto que no se centra exclusivamente en la complementariedad de las interacciones π-π. Además, presentan una capacidad de carga del orden de cinco veces superior con respecto a sus análogas monoméricas, lo que permite suponer que la estructura del oligómero está involucrada en el reconocimiento molecular de los compuestos racémicos. Sin embargo, la enantioselectividad de las FEQs de poliprolina se ve fuertemente afectada por la composición de la fase móvil que se utiliza. Las fases móviles de polaridad intermedia proporcionan separaciones quirales de elevada enantioselectividad. Sin embargo, en presencia de disolventes apolares, como el cloroformo, la enantioselectividad de las columnas de poliprolina se anula por completo. Este fenómeno es reversible, y se atribuye al cambio conformacional que experimentan los oligómeros de poliprolina según en el disolvente en que se encuentran. Los estudios de Dicroísmo Circular y RMN concluyen que los oligómeros de prolina poseen una conformación helicoidal estable de tipo PPII (trans) en disolventes polares. En cloroformo, los oligómeros presentan una distribución aleatoria cis/trans de ambas conformaciones helicoidales PPI y PPII, respectivamente. Este resultado permite concluir que el reconocimiento cromatográfico enantioselectivo se debe a la estructura helicoidal PPII que adopta el oligómero, y es presumible que el mecanismo de reconocimiento de los enantiómeros esté dirigido por la formación de un enlace de hidrógeno con el grupo carbonilo de amida del enlace peptídico. Por otra parte, los grupos arilaminocarbonil, distribuidos a lo largo de la cadena peptídica, juegan un papel importante amplificando el enantioreconocimiento. La inmovilización de los mismos derivados de poliprolina sobre matrices de gel de sílice monolítica permite la incorporación de una mayor cantidad de SQ y, consecuentemente, las FEQs monolíticas presentan una mayor enantioselectividad, campo de aplicación y capacidad de carga con respecto a sus análogas de sílice en partículas. La elevada permeabilidad y eficiencia de los lechos monolíticos permite obtener separaciones cromatográficas hasta cuatro veces más rápidas, sin pérdida de resolución. Por lo que se concluye que las columnas monolíticas con derivados de poliprolina constituyen unos buenos candidatos para separaciones de tipo preparativo y, a su vez, permiten su uso en análisis de rutina rápidos.

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Nowadays, enantioselective chromatography using chiral stationary phases (CSPs) is the most widely used technique for the separation of enantiomers at analytical and preparative scale. In contrast to low molecular mass selectors, polymers tend to produce CSPs with a much broader application domain and loadability, properties that are often related to the ordered secondary structure in which these polymers are organized. In this work it is evaluated the adequacy of polyproline derivatives as chiral selectors (CS) for the separation of enantiomers by HPLC. The polyproline derivatives are prepared using a solid phase peptidic synthetic procedure. The individual proline units are modified with a 3,5- dimethylphenylcarbamate moiety to introduce interaction sites with the ability to participate in the recognition mechanism of the enantiomers. The polyproline oligomers obtained are covalently linked to silica gel chromatographic supports, and the resulting CSPs are packed in conventional HPLC columns. The chromatographic behaviour of the resulting polyproline CSPs is evaluated and compared with those containing an analogous monomeric proline. The chromatographic comparative studies conclude that polyproline CSPs present a higher enantioselectivity and a broader application domain than their monomeric counterparts. These results suggest a different recognition mechanism for polyproline, which is not exclusively centred on the complementarity of π-π interactions. Furthermore, the loading ability for the polyproline columns is five orders of magnitude superior with respect to their monomeric counterparts, a fact that also suggest an involvement of the oligomer structure in the molecular recognition of the enantiomers. Nevertheless, for polyproline CSPs, the enantioselectivity is highly dependent on the mobile phase used. This phenomenon is proved to be reversible and it is attributed to a conformational change in the oligomer structure. The immobilization of these polyproline derivatives on monolithic chromatographic matrices permits to obtain a higher CS coverage. Thus, monolithic polyproline columns demonstrate separation factors, enantioselectivity, applicability and a higher loading ability with respect to the analogous silica-based columns. Moreover, the high permeability and efficiency that characterizes the monolithic supports permits to reduce considerably the analysis time. In summary, it is concluded that the monolithic columns modified with polyproline derivatives are considered excellent candidates for enantioselective preparative separations and, in turn, these columns can be used for fast routine analysis.

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Tesis Doctorals - Departament - Farmacologia i Química Terapèutica

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Preparación, estudio estructural y aplicabilidad de derivados de poli-(4R)-hidroxi-L-prolina en la separación de enantiómeros por técnicas cromatográficas y relacionadas