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Diagnóstico y seguimiento microbiológico de la colonización respiratoria por Pseudomonas aeruginosa en fibrosis quística

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Universitat de Barcelona. Departament d'Anatomia Patològica, Farmacologia i Microbiologia

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[spa]  La fibrosis quística (FQ) es la primera causa de patología pulmonar crónica en la infancia. La colonización más frecuente es por P.aeruginosa y se asocia con un mayor deterioro de la función pulmonar, menor supervivencia y peor pronóstico. Su detección precoz permite instaurar tratamiento antibiótico para erradicar la bacteria y evitar o retrasar la infección crónica. El cultivo seriado del esputo es la técnica utilizada en el seguimiento microbiológico habitual para definir el estadio de colonización pulmonar. Sin embargo, puede ser negativo en pacientes con tratamiento antimicrobiano, baja carga bacteriana o cuando no se pueden obtener muestras respiratorias de suficiente calidad, como ocurre en los niños, en los que se utiliza principalmente el exudado faríngeo. La detección de anticuerpos anti-P.aeruginosa en suero o la detección del DNA de la bacteria en muestras respiratorias podrían mejorar el diagnóstico precoz de la colonización por P.aeruginosa. El objetivo del estudio ha sido evaluar cultivo, detección del DNA y anticuerpos específicos en el diagnóstico de la colonización respiratoria por P.aeruginosa en niños con FQ. El estudio ha incluido un primer análisis con 116 pacientes, en diferentes estadios de colonización por P.aeruginosa, para establecer los mejores puntos de corte para diferenciar entre pacientes colonizados y no colonizados y entre pacientes con y sin colonización crónica, y un análisis posterior del seguimiento de 68 pacientes durante dos años. La detección cuantitativa del DNA se realizó mediante PCR en tiempo real de dos secuencias de los genes toxA y gyrB de P.aeruginosa y los resultados se expresaron como unidades formadoras de colonías por ml (UFC/ml). La determinación del título de anticuerpos IgG frente a elastasa (ELA), proteasa alcalina (PA) y exotoxina A (ETA) de P.aeruginosa se realizó con el equipo anti-Pseudomonas aeruginosa IgG EIA (Mediagnost®. Reutlingen, Alemania). Para identificar colonización por P.aeruginosa, la sensibilidad de la PCRgyrB fue mejor que la del cultivo o la PCRtoxA, con especificidad similar. Los mejores resultados se obtienen combinando la PCRgyrB≥35UFC/ml con el cultivo. La sensibilidad (86,0%) es superior con especificidad (97,3%) similar respecto al cultivo aislado (44,2% y 100%). Combinando cultivo y PCRgyrB≥35UFC con la detección de anticuerpos anti-ELA≥1/240 o con la detección de anticuerpos frente a los tres antígenos de P.aeruginosa (PA≥1/180 y/o ELA≥1/240 y/o ETA≥1/800) mejora la sensibilidad (93,0% y 88,4%) pero disminuye la especificidad (86,3% y 80,8%). El análisis del seguimiento de los 68 pacientes durante 24 meses confirma estos resultados. La sensibilidad de cultivo y PCRgyrB≥35UFC combinadas (93,9%), es superior al cultivo aislado (68,6%) aunque la especificidad (84,8%) continúa siendo menor que la del cultivo (100%). La media de tiempo desde el inicio del seguimiento hasta el primer resultado positivo para la PCRgyrB≥35UFC (4,9 meses) y para la detección de anticuerpos anti-ELA≥1/240 (6,0) fueron significativamente (p<0,001 y p<0,05) menores que para el cultivo (9,2). Para identificar colonización crónica por P.aeruginosa, los mejores resultados se obtienen con las técnicas de detección de anticuerpos, independientemente del resultado del cultivo. Combinando la detección de anticuerpos frente a los tres antígenos (PA≥1/1900 y/o ELA≥1/1500 y/o ETA≥1/1900), la sensibilidad (88.2%) es superior al cultivo (64,7%) con igual especificidad (91,9%). Utilizando los criterios de interpretación recomendados por el manual de la técnica (PA y/o ELA y/o ETA≥1/1250) los resultados son peores. Cuando el cultivo es positivo únicamente la detección de anticuerpos se asocia estadísticamente con el diagnóstico de colonización crónica. Cuando el resultado del cultivo es negativo tanto la detección de anticuerpos como un resultado de PCRgyrB≥5000UFC/ml o la combinación de ambas se asocian con colonización crónica por P.aeruginosa.

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[eng] Cystic fibrosis (CF) is the leading cause of chronic lung disease in childhood. The colonization of these patients’ airways by P.aeruginosa is associated with greater decline in lung function and worse prognosis. Early detection allows the start of antibiotic treatment to prevent chronic infection. The serial culture of respiratory samples is used in the microbiological monitoring to define the stage of lung colonization. Detection of serum specific antibodies or DNA from the bacteria in respiratory samples could improve early diagnosis of colonization by P.aeruginosa. The aim of this study was to evaluate culture, detection of DNA and specific antibodies in the diagnosis of respiratory colonization by P.aeruginosa in CF patients, to differentiate colonized patients from non-colonized and patients with and without chronic colonization. Quantitative detection of the genetic sequences gyrB and toxA of P.aeruginosa, was performed by real-time PCR and expressed as colony forming units per ml (CFU/ml). Quantitative detection of IgG antibodies against elastase (ELA), alkaline protease (AP) and exotoxin A (ETA) of P.aeruginosa was performed by Pseudomonas aeruginosa anti-IgG EIA kit (Mediagnost®. Reutlingen, Germany). To identify colonization, the best results were obtained by combining PCRgyrB≥35CFU/ml and culture. Sensitivity (86.0%) was high with similar specificity (97.3%) compared to culture alone (44.2% and 100%). Adding anti-ELA≥1/240 antibodies detection or antibodies against all three antigens (PA≥1/180 and/or ELA≥1/240 and/or ETA≥1/800) enhanced the sensitivity (93.0% and 88.4%) but decreased the specificity (86.3% and 80.8%). In 68 patients followed for 24 months, the mean time from the beginning to the first positive result for PCRgyrB≥35CFU/ml (4.9 months) was significantly (p<0.001) lower than that from culture (9.2 month). To identify chronic colonization, the best results were obtained with antibody detection, regardless of culture result. Sensitivity (88.2%) of combining the antibodies detection against all three antigens (PA≥1/1900 and/or ELA≥1/1500 and/or ETA≥1/1900) was above culture (64.7%) with the same specificity (91.9%). When culture was positive, antibodies detection was the only method statistically associated with chronic colonization. When culture was negative, antibodies and PCRgyrB≥5000CFU/ml or the combination of both were associated with chronic colonization by P.aeruginosa.

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Tesis Doctorals - Departament - Anatomia Patològica, Farmacologia i Microbiologia

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Diagnóstico y seguimiento microbiológico de la colonización respiratoria por Pseudomonas aeruginosa en fibrosis quística