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Structural and functional analysis of natural protein-based inhibitors and their protease targets

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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[eng] Several proteases and their antagonistic protein or peptide inhibitors sparked researchers’ interest due to their potential as therapeutic targets. The present thesis, which compiles results obtained in three independent projects, unravels new information regarding protease and protease inhibitor structures and their mechanisms of action.
In the first project, we assessed the involvement of human reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK) in embryogenesis and tumour suppression by investigating its involvement in the regulation of matrix metalloproteinases (MMPs). We developed bacterial and eukaryotic expression systems for the production of RECK variants and established an exhaustive purification protocol. The inhibitory activity of RECK variants towards MMP-2, MMP-7, MMP-9, and MMP-14 catalytic domain was assessed using fluorogenic peptides and natural protein substrates. Contrary to the published literature, no significant MMP inhibition was detected, suggesting that RECK is not a direct inhibitor of MMPs activity (Mendes et al., 2020).
In the second project, we aimed to develop a specific and potent inhibitor of aureolysin, a protease and key virulence factor secreted by the human pathogen Staphylococcus aureus. The insect metallopeptidase inhibitor (IMPI) is a defensive molecule produced by the greater wax moth Galleria mellonella, which effectively and potently inhibits thermolysins from some pathogenic bacteria. In the thesis we evaluated IMPI inhibition of aureolysin activity in vitro and explored its mechanism of action through analysis of the crystallographic structure of the complex. Furthermore, in an attempt to obtain a more effective or specific aureolysin inhibitor, we designed a set of twelve mutants displaying single or multiple point mutations in the reactive-centre loop. The best aureolysin inhibition was achieved by the I57F mutant, with a calculated inhibition constant (Ki) of 346 nM. The work presented here provides extra input for the development of therapeutic proteins and peptide-based inhibitors based on IMPI and its inactivation mechanism for the treatment of infections caused by antibiotic resistant pathogens (Mendes et al., 2022).
In the third project, a highly collaborative work was developed in order to explore the unique inhibitory mechanism of human plasma ⍺2M (h⍺2M), a homotetrameric protein of approximately 720 kDa, present in high concentrations in human plasma that performs several functions including the inhibition of peptidases. In this project we obtained eight ⍺2M structures by cryo electron microscopy (cryo-EM) elucidating the previously theoretical “Venus fly-trap” mechanism which allows the non- specific inactivation of up to two protease molecules independently of their catalytic type (Luque et al., 2022). Sparked by remarks during the review process of this paper, we then compared the function and biophysical properties of h⍺2M purified from fresh plasma with that of thawed frozen plasma through a range of experiments, providing light on this for the very first time, and demonstrating, that both h⍺2M preparations are indistinguishable (Mendes et al., in preparation).

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[spa] Las proteasas han estado asociadas desde los inicios de la bioquímica a la digestión indiscriminada y degradación de proteínas nutricionales y/o defectuosas. Sin embargo, la participación de estos enzimas en la escisión específica, compleja y precisa de sustratos proteicos  diana  concretos  se  hizo  evidente  a  medida  que  incrementaban  el  número  de estudios. A la par, varios de estos estudios evidenciaron el papel de las proteasas como actrices  principales  en  multitud  de  procesos  fisiológicos.  Actualmente  se  sabe  que  la desregulación de la actividad de estas moléculas clave es consecuencia de varias condiciones patológicas. La regulación de la actividad de las proteasas es esencial para la homeostasis y se  logra  mediante  diversos  mecanismos,  como  el  control  de  la  expresión  génica,  la compartimentación  de  proteínas,  la  producción  de  proformas  latentes  (zimógenos)  que requieren una activación posterior y la interacción con inhibidores de proteínas y péptidos. Todas las formas de vida cuentan con un repertorio diverso de proteasas e inhibidores de estas que funcionan de manera concertada y sinérgica. Es importante destacar que varias proteasas y sus inhibidores de péptidos o proteínas antagonistas han venido despertando el interés de investigadores debido a su gran potencial como dianas terapéuticas.La presente tesis presenta nueva información sobre las estructuras de proteasas e inhibidores  de  proteasas  y  sus  mecanismos  de  acción.  Esta  tesis  recopila  los  resultados obtenidos  en  tres  proyectos  que  abordan  este  tema  centrándose  en  distintas  proteasas  e inhibidores.En el primer proyecto, revisamos la participación de la proteína “reversion-inducing cysteine-rich  protein  with  Kazal  motifs”  (RECK)  en  la  embriogénesis,  la  supresión  de tumores y su implicación en la regulación de las metaloproteinasas de matriz (MMP). Las MMPs son proteasas involucradas principalmente en la degradación de los componentes proteicos de la matriz extracelular (ECM) y se ha descrito que son inhibidas por trestipos de proteínas: la ⍺2-macroglobulina (α2Μ), los inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP)  y  RECK.  En  particular,  la  eliminación  o  disminución  de  los  niveles  de  RECK provoca la muerte de embriones de ratón y también una mayor invasión tumoral ymetástasis en una plétora de cánceres humanos. Ambos fenotipos están asociados con la alteración profunda de estructuras vasculares. En el marco de esta tesis desarrollamos sistemas de expresión bacterianos y eucariotas para la producción de variantes de RECK y establecimos un protocolo de purificación exhaustivo. Se evaluó la actividad inhibidora de las variantes XVIde RECK frente a MMP-2, MMP-7, MMP-9 y al dominio catalítico de MMP-14 utilizando péptidos fluorigénicos y proteínas naturales como sustratos. Durante los estudios realizados, no se detectó inhibición significativa de las MMP, lo que claramente indica que RECK no es un inhibidor directo de la actividad de MMPs (Mendes et al., 2020).En el segundo proyecto, nuestro objetivo fue desarrollar un inhibidor específico y potente de la aureolisina, una proteasa secretada por el patógeno humano Staphylococcus aureus. En la actualidad, se está observando el aumento descontrolado de cepas resistentes a los antibióticos responsables de infecciones leves o potencialmente mortales. S.aureus, uno  de  esos  patógenos,  está  equipado  con  varias  proteasas  secretadas  que  anulan  los mecanismos de defensa del huésped, una de las cuales es la aureolisina. No se conoce ningún inhibidor específico de la aureolisina, que sin duda sería un valioso complemento para la terapia con antibióticos. El inhibidor de metalopeptidasas de insectos (IMPI) es una molécula defensiva  única  de  bajo  peso  molecular  producida  por  la  polilla  de  la  cera Galleria mellonella, que inhibe eficaz y potentemente las termolisinas de algunas bacterias patógenas, una familia de metalopeptidasas a la que pertenece la aureolisina. En la tesis evaluamos la inhibición de la actividad de la aureolisina por parte de IMPI in vitroy también exploramos su mecanismo de acción a través del análisis de la estructura cristalográfica del complejo. Concluimos que el mecanismo de inhibición implica la escisión proteolítica por parte de la proteasa  del  inhibidor  dentro  del  complejo,  un  mecanismo  de  inhibición  atípico  de metalopeptidasas.  Asimismo,  en  un  intento  por  obtener  un  inhibidor  de  aureolisina  más eficaz o específico, diseñamos un conjunto de doce mutantes diferentes con mutaciones puntuales  únicas  o  múltiples  en  el  bucle  del  centro  reactivo.  La  mejor  inhibición  de aureolisina se logró con el mutante I57F, con una constante de inhibición (Ki) de 346nM. Teniendo  en  cuenta  la  ausencia  de  termolisinas  en  animales,  el  trabajo  aquí  presentado podría sentar las bases para el desarrollo de proteínas y péptidos terapéuticos basados en IMPI para el tratamiento de infecciones causadas por patógenos resistentes a los antibióticos (Mendes et al., 2022).En  el  tercer  proyecto,  se  desarrolló  un  trabajo  colaborativo  para  explorar  el mecanismo inhibidor único de la ⍺2M de plasma humano(h⍺2M). La h⍺2M es una proteína homotetramérica  glicosilada  de  alto  peso  molecular  (720kDa)  presente  en  altas concentraciones  en  plasma  humano.  Realiza  varias  funciones,  incluidos  el  transporte  de moléculas de señalización y la inhibición de peptidasas. Su mecanismo de acción, conocido como  “trampa  Venus”,  permite  la  inactivación  inespecífica  de  hasta  dos  moléculas  de proteasa,  independientemente  del  tipo  catalítico.  En  este  proyecto,  obtuvimos  ocho 
XVIIestructuras  de ⍺2M  mediante  criomicroscopía  electrónica (cryo-EM),  tanto  de  estados nativos como inducidos, que demuestran que la proteína nativa es muy flexible y muestra una  conformación  abierta  que  cambia  a  una  cerrada  tras  la  inducción  por  la  peptidasa atrapada, exponiendo el dominio de unión al receptor (Luque et al., 2022). Impulsados por los comentarios durante la revisión del manuscrito, procedimos posteriormente a comparar las propiedades biofísicas y funcionales de h⍺2M purificada a partir de plasma fresco no congelado  con  proteína  obtenida  a  partir  deplasma  congelado  (Mendes et  al.,  en preparación).

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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Structural and functional analysis of natural protein-based inhibitors and their protease targets