# name
Metal-dependent 2-oxoacid aldolases as versatile biocatalysts for the synthesis of chiral multifunctional compounds

# metadata.dc.contributor.other[].value
Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

# metadata.dc.description.abstract[].value
[eng] Biocatalysis gained importance in the latter half of the 20th century and its application in the pharmaceutical, food and chemical industries continues to expand nowadays. Enzymes catalyze chemical reactions in a highly selective manner, achieving high molecular complexity without the need of protection and deprotection steps and usually under mild reaction conditions. Particularly important classes of enzymes are aldolases, which catalyze stereoselectively carbon-carbon bond formation between a nucleophilic donor and an electrophilic acceptor. The aldol adducts are usually typified as β- hydroxycarbonyl compounds, a structural element that is frequently found in the framework of complex molecules. For this reason, advances in this field are focused on finding new aldolases with unprecedented activities and engineering those available for improved substrate tolerance and stereoselectivity.

In this thesis, we exploited the potential capacities of two Class II aldolases that utilize 2-oxoacids and aldehydes as substrates, to furnish different chiral molecules that are used as building blocks in organic chemistry. These are YfaU (2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase, EC 4.1.2.53), which was used as a robust biocatalyst in previous investigations in our group, and KPHMT (ketopantoate hydroxymethyltransferase, EC 2.1.2.11), which was employed with synthetic applications for the first time in this present work.

In chapter 3.1 MBP-YfaU and KPHMT were applied to the synthesis of 2- substituted 3-hydroxycarboxylate esters (i.e., Roche ester, 3-hydroxy-2- methylpropanoate), which are an important class of chiral building blocks widely used in organic synthesis. To do this, KPHMT from E. coli was cloned, expressed, and characterized (e.g., metal cofactor, nucleophile substrates, tolerance to formaldehyde). Then, a panel of different 2-oxoacids was synthetized, and based on molecular models, four variants of KPHMT were constructed to increase the substrate scope of this catalyst. Finally, the aldol addition of different 2-oxoacids to formaldehyde catalyzed by KPHMT and MBP-YfaU wild-type and variants was deeply studied and it was determined
 
that they generated stereocomplementary aldol adducts. Oxidative decarboxylation and esterification of the aldol adducts led to the formation of Roche ester derivatives with high isolated yields and excellent enantiomeric excesses.

In chapter 3.2 KPHMT was used in the synthesis of compounds bearing quaternary carbon centers. To this end, 3,3-disubstituted 2-oxoacid nucleophiles and a panel of selected aldehydes were used as substrates. Based on molecular models, residue V214 was targeted for site directed mutagenesis and five new variants that were useful for the synthesis of these congested compounds were produced. Different methodologies on the aldol adducts rendered 2-oxolactones (including a bicyclic lactone), 3-hydroxyacid derivatives and ulosonic acid type products, all of them bearing gem-dialkyl, gem-cycloalkyl and spirocyciclic quaternary centers.

In chapter 3.3 preliminary studies for the application of KPHMT and MBP- YfaU to the synthesis of nucleoside analogues were performed. As substrates we selected 2-oxoacids and D-glyceraldehyde derivatives, including O- protected D-glyceraldehde and α,α-disubstituted-α-hydroxy aldehydes. The subsequent oxidative decarboxylation of the aldol adducts rendered diverse lactones and carboxylic acids. These products with different substituents at C2 and at C4 can be used as precursors for the synthesis of nucleoside analogues.

# metadata.dc.description.abstract[].value
[cat] La biocatàlisi va guanyar importància durant la segona part del segle XX i la seva aplicació en les indústries farmacèutica, química i alimentària es continua expandint avui dia. Els enzims catalitzen reaccions químiques de manera selectiva, produint molècules d’alta complexitat, usualment en condicions suaus de reacció. Les aldolases són un tipus d’enzims que catalitzen de manera estereoselectiva la formació d’enllaços carboni-carboni entre un donador (nucleòfil) i un acceptor (electròfil). Els adductes aldòlics són classificats com a compostos β-hidroxicarbonílics, elements estructurals que formen part de molècules complexes. Els progressos en aquest camp es focalitzen en trobar noves aldolases amb activitats no descrites, o en modificar les ja conegudes per tal d’incrementar la tolerància per diferents substrats o per millorar l’estereoquímica dels productes obtinguts.

En aquesta tesi, ens vam centrar en investigar les capacitats de dues aldolases de Classe II, que usen 2-oxoacids i aldehids com a substrats, per sintetitzar diferents molècules quirals que són usades com a elements fonamentals en química orgànica. Aquestes són la YfaU (2-keto-3-deoxy- L-rhamnonate aldolase, EC 4.1.2.53), que va ser usada com a biocatalitzador en investigacions prèvies en el nostre grup d’investigació, i la KPHTM (ketopantoate hydroxymethyltransferase, EC 2.1.2.11), que ha estat usada amb aplicacions sintètiques per primer cop en aquest treball.

En el capítol 3.1, la MBP-YfaU i la KPHMT van ser aplicades per la síntesi d’esters carboxílics substituits al C2 i amb un grup hidroxil al C3 (un exemple és l’ester de Roche, 3-hidroxi-2- metilpropanoat). Per fer-ho, la KPHMT d’E. coli va ser clonada, expressada i caracteritzada. També es van sintetitzar diferents 2-oxoacids i es van dissenyar quatre variants de la KPHMT per tal d’incrementar la varietat de substrats acceptats per aquest catalitzador. Finalment, es va estudiar la addició aldòlica dels diferents 2-oxoacids al formaldehid catalitzada per la KPHMT o per la MBP-YfaU i es va determinar que les dues aldolases son estereocomplementaries. La descarboxilació i l’esterificació dels adductes aldòlics van permetre generar derivats d’esters de Roche amb bons rendiments i bons excessos enantiomèrics.

En el capítol 3.2 la KPHMT va ser usada en la síntesi de compostos que contenen un carboni quaternari. Per fer-ho, es van sintetitzar diferents 2-oxoacids disubstituits en el C3 i un panell d’aldehids que van ser usats com a substrats. A més, oel residu V214 de l’enzim va ser seleccionat per ser mutat i es van construir cinc noves variants que van ser útils per la síntesi d’aquests compostos. Les diferents metodologies aplicades sobre els adductes aldòlics van generar 2- oxolactones, derivats de 3-hidroxiacids, i productes semblants a l’àcid ulosonic, tots ells amb centres quaternaris del tipus gem-dialquil, gem-cycloalquil i espirocíclics.

En el capítol 3.3 es van fer estudis preliminars per l’aplicació de la KPHMT i la MBP-YfaU per la síntesi d’anàlegs de nucleòsids. Com a substrats es van usar els 2-oxoacids disponibles de capítols anteriors i es van sintetitzar derivats del D-gliceraldehid (incloent D-gliceraldehid O- protegit i aldehids α-hidroxi-α,α-disubstituïts). La descarboxilació dels adductes aldòlics van generar diferents lactones i àcids carboxílics amb diferents substituents als carbonis 2 i 4, que poden ser usats com a precursors per la síntesi d’anàlegs de nucleòsids.

# metadata.dc.source[].value
Tesis Doctorals - Facultat - Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

# metadata.dc.title[].value
Metal-dependent 2-oxoacid aldolases as versatile biocatalysts for the synthesis of chiral multifunctional compounds