# name
Design, synthesis and biological evaluation of photoswitchable molecules targeting G protein-coupled receptors in retina

# metadata.dc.contributor.other[].value
Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

# metadata.dc.description.abstract[].value
[eng] G protein-coupled-receptors (GPCRs) are the largest family of membrane proteins and mediate important cellular responses. Metabotropic glutamate receptors (mGlu) belong to the Glutamate family/Class C GPCR. These receptors are widely expressed in the nervous system and, thus, considered promising targets for the treatment of several neurologic disorders. The activity of mGlu is modulated by agonists such as glutamate but it can also be positively/negatively tuned by allosteric modulators (PAMs and NAMs, respectively). Allosteric modulators have several advantages over agonists as for example higher receptor selectivity since allosteric pocket is less conserved than the orthosteric site. Allosteric modulators targeting receptors such as mGlu5 or mGlu4 have the therapeutic potential to treat Parkinson’s disease, among others. However, mGlu6 has been barely explored due to its restricted localisation in retina and thus there is a lack of information on allosteric modulators targeting this receptor. Nevertheless, mGlu6 is known to be essential for retina function and therefore could be targeted to treat vision disorders. In the recent years, photoswitchable allosteric ligands have been developed to dynamically control mGlu within the Photopharmacology field. Photopharmacology is an emerging field of research that is based on conferring photosensitivity to proteins without the need for genetic manipulation. This approach uses light-regulated drugs to control the functional activity of proteins by means in a very precise manner. To that aim, these ligands contain a photoswitch moiety such as an azo bond (i.e. azobenzenes) which is light-sensitive. 
The main objective of the present thesis is to design and synthesise azobenzene-containing photoisomerisable compounds acting as allosteric modulators that would enable the light-control of mGlu6. Then, to use these pharmacological tools in the development of novel treatments for vision disorders. 
In the first chapter, we report the design and synthesis of two different families of a published mGlu4/6 PAM derivatives. We also describe the development of in vitro (mGlu4/6) pharmacological assays and molecular modelling (mGlu4/6) methodologies to evaluate the activity and binding of light-regulated ligands synthesised. None of the photoswitchable derivatives conserve the activity of original molecule towards mGlu6. These experimental results are in line with molecular modelling studies performed, including molecular dynamics. However, compound 75 presents a slight cis-on PAM activity. This compound is further tested in mGlu4, and we observe a similar pharmacological profile. Overall, this new compound can serve as a new scaffold for the design of cis-on allosteric modulators for the optimal control of mGlu4/6 receptors. Next, we participate in a multidisciplinary project named Drug4Sight which aims at developing trans-on ago PAMs targeting mGlu6 that show fast-thermal relaxation and red-shifted profile to treat visual disorders (Chapter 2 and 3). The starting point of the project is a slow-relaxing ago-PAM (40) showing activity towards mGlu4/6. First, we attempt to improve the selectivity of compound 40 by designing derivatives bearing a covalent warhead to target a non-conserved cysteine in mGlu6 (Chapter 2). We base our design on docking studies involving 40 and a model of mGlu6. The compounds are synthesised, photocharacterised and their reactivity towards thiol nucleophilic compounds is assessed. We found reactivity towards these nucleophiles in some derivatives and the molecular dynamics suggest that the interaction between electrophilic moiety and cysteine can take place. However, we could not test these compounds as covalent ligands in vitro since the experimental methodology required cellular assay optimizations that are beyond the scope of this thesis. In Chapter 3, we design and synthesise three different families of mGlu6 reversible allosteric ligands based on reported 40 with the aim of improving activity/selectivity, optimal wavelength and thermal-relaxation, respectively. With the first family we initially study PAM  40 in the mGlu6 binding pocket and then synthesise a family of derivatives to corroborate the molecular modelling analysis and to improve our molecular design. Compound 97 presents a better activity and photoisomerization properties than 40 as mGlu6 trans-on PAM. In contrast, compound 125 displays mGlu6 cis-on PAM activity. Both compounds are used to dynamically modulate mGlu6 cellular activity in vitro using 380 nm irradiation. The mGlu6 binding mode of the trans-on compound 97 is studied by docking and molecular dynamics. However, the cis-isomer thermal relaxation of compound 97 is too slow and not optimal for the project. In the second family, we obtained several red-shifted photoisomerization derivatives of the parent mGlu6 PAM 40. The red-shifted azobenzene 210 is more active than 40 and we apply molecular modelling to understand the structural reasons for these differences. However, we could not experimentally use 550 nm light to significantly modulate the mGlu6 cell activity of 210 in vitro. Finally, we design and synthesise a third family of fast-relaxing photoisomerisable molecules. As a result, two compounds (238 and 240) display mGlu6 trans-on PAM activity similar to that of 40 but with improved photochemical properties. Compounds 238 and 240 are tested in blind zebrafish and found to improve the visual acuity in this model of animals. In addition, these two compounds are tested in retina damaged Opn4-/- mice through conditioned place preference (CPP) experiments. The experiments result in an improvement in mice vision after topical treatment with mGlu6 trans-on PAMs 238 and 240,  yielding better results in vivo than the parent azobenzene 40. 
In conclusion, the present thesis describes original mGlu6 trans-on PAM compounds, which are obtained using new synthetic, pharmacological and computational methodologies developed to study the mGlu6 receptor. The pharmacological tools have been applied to the development of proof-of-concept  in vivo studies with encouraging results for future potential treatments of visual disorders.

# metadata.dc.description.abstract[].value
[cat] Els receptors acoblats a proteïnes G (GPCR) són la família més gran de proteïnes de membrana i regulen respostes cel·lulars importants. Els receptors de glutamat metabotròpics (mGlu) pertanyen a la família del glutamat/Classe C GPCR. Aquests receptors s'expressen àmpliament al sistema nerviós i, per tant, es consideren dianes terapèutiques prometedores per al tractament de diversos trastorns neurològics. L'activitat de mGlu està modulada per agonistes com el glutamat, però també es pot ajustar positivament/negativament per moduladors al·lostèrics (PAM i NAM, respectivament). Els moduladors al·lostèrics tenen diversos avantatges respecte als agonistes, com per exemple una major selectivitat del receptor, ja que el lloc d’unió al·lostèric es conserva menys que el lloc ortostèric. Els moduladors al·lostèrics dirigits a receptors com mGlu5 o mGlu4 tenen el potencial terapèutic per tractar la malaltia de Parkinson, entre d'altres. Tanmateix, mGlu6 amb prou feines s'ha explorat a causa de la seva localització restringida a la retina i, per tant, hi ha una manca d'informació sobre moduladors al·lostèrics dirigits a aquest receptor. No obstant això, se sap que mGlu6 és essencial per a la funció de la retina i, per tant, es podria estudiar per desenvolupar possibles teràpies per a trastorns de la visió. En els últims anys, s'han desenvolupat lligands al·lostèrics fotocròmics per controlar dinàmicament mGlu dins del camp de la fotofarmacologia. La fotofarmacologia és un camp d'investigació emergent que es basa a conferir fotosensibilitat a proteïnes sense necessitat de manipulació genètica. Aquesta aproximació utilitza fàrmacs regulats per la llum per controlar l'activitat funcional de les proteïnes d'una manera molt precisa. Amb aquest objectiu, aquests lligands estan basats en l’azobenzè i contenen un grup fotocròmic, l’enllaç azo, que és sensible a la llum.
L'objectiu principal de la tesi és dissenyar i sintetitzar compostos fotocròmics basats en l’azobenzè que actuïn com a moduladors al·lostèrics que permetin el control de mGlu6 mitjançant llum. Després, utilitzar aquestes eines farmacològiques en el desenvolupament de nous tractaments per als trastorns de la visió.
En el primer capítol, descrivim el disseny i la síntesi de dues famílies diferents de derivats d’un PAM reportat de mGlu4/6. També es descriu el desenvolupament d'assajos farmacològics in vitro (mGlu4/6) i de models moleculars (mGlu4/6), ambdues metodologies s’utilitzen per avaluar els lligands sintetitzats. Cap dels derivats fotocròmics conserva l'activitat en mGlu6 de la molècula original. Aquests resultats experimentals són coherents amb els estudis de modelització molecular realitzats, inclosa la dinàmica molecular. Tanmateix, el compost 75 presenta una lleu activitat cis-on PAM. Aquest compost es prova en mGlu4 i observem un perfil farmacològic similar. De fet, aquest nou compost pot servir com una nova estructura inicial per al disseny de moduladors al·lostèrics cis-on per aconseguir un control òptim dels receptors mGlu4/6. A més, participem en un projecte multidisciplinari anomenat Drug4Sight que té com a objectiu desenvolupar ago-PAMs trans-on dirigits a mGlu6 que mostrin una relaxació tèrmica ràpida i una longitud d’ona òptima per la fotoconversió que es trobi en l’espectre vermell del visible per tractar trastorns visuals (Capítol 2 i 3). El punt de partida del projecte és un ago-PAM de relaxació lenta (40) que mostra activitat cap a mGlu4/6. En primer lloc, intentem millorar la selectivitat del compost 40 dissenyant derivats que inclouen un grup electrofílic per capturar una cisteïna no preservada de mGlu6 (Capítol 2). Basem el nostre disseny en estudis de docking amb el compost 40 i un model de mGlu6. Els compostos són sintetitzats, fotocaracteritzats i també s'avalua la seva reactivitat cap a compostos que contenen un tiol. Vam trobar reactivitat cap a aquests nucleòfils en alguns derivats i la dinàmica molecular suggereix que la interacció entre el grup electrofílic i la cisteïna pot tenir lloc. Tanmateix, no vam poder provar aquests compostos com a lligands covalents in vitro, ja que la metodologia experimental requeria optimitzacions en l’assaig cel·lular que estaven fora de l'abast d'aquesta tesi. Al capítol 3, dissenyem i sintetitzem tres famílies diferents de lligands al·lostèrics reversibles per mGlu6 basant-nos en el compost 40 amb l'objectiu de millorar l'activitat/selectivitat, la longitud d'ona òptima i la relaxació tèrmica, respectivament. Amb la primera família estudiem inicialment el lloc d’unió del PAM 40 en mGlu6 i després sintetitzem una família de derivats per corroborar les observacions fetes amb modelització molecular i millorar el nostre disseny molecular. El compost 97 presenta una millor activitat i propietats de fotoisomerització en comparació al 40 com a mGlu6 trans-on PAM. En canvi, el compost 125 mostra activitat mGlu6 cis-on PAM. Tots dos compostos s'utilitzen per modular dinàmicament l'activitat cel·lular de mGlu6 in vitro mitjançant llum de 380 nm. El mode d'unió mGlu6 del compost trans-on 97 s'estudia mitjançant docking i dinàmica molecular. No obstant això, la relaxació tèrmica de l'isòmer cis del compost 97 és massa lenta i no és òptima per al projecte. En la segona família, vam obtenir diversos derivats del compost 40 amb la longitud d’ona òptima desplaçada cap al vermell del visible.  El compost  210, amb una longitud d’ona òptima de 380 o 550 nm, és més actiu que el 40 i apliquem modelització molecular per entendre les raons estructurals d'aquestes diferències. Tot i això, no vam poder utilitzar experimentalment llum de 550 nm per modular significativament l'activitat cel·lular de mGlu6 amb el 210 in vitro. Finalment, dissenyem i sintetitzem una tercera família de molècules fotocròmiques de relaxació ràpida. Com a resultat, dos compostos (238 i 240) mostren una activitat trans-on PAM en mGlu6 similar a la del 40, però amb propietats fotoquímiques millorades. Els compostos 238 i 240 es van provar en peixos zebra cecs i es va trobar que milloren l'agudesa visual en aquest model d'animals. A més, aquests dos compostos es posen a prova en ratolins Opn4-/- amb la retina danyada mitjançant experiments de preferència de lloc condicionat (CPP). Els experiments donen lloc a una millora de la visió dels ratolins després del tractament tòpic amb mGlu6 trans-on PAMs 238 i 240, donant millors resultats in vivo que l'azobenzè 40.
En conclusió, aquesta tesi descriu compostos trans-on PAM per a mGlu6, que s'obtenen mitjançant noves metodologies sintètiques, farmacològiques i computacionals desenvolupades per estudiar el receptor mGlu6. Les eines farmacològiques s'han aplicat al desenvolupament d'estudis de prova de concepte in vivo amb resultats encoratjadors per a futurs tractaments potencials de trastorns visuals.

# metadata.dc.source[].value
Tesis Doctorals - Facultat - Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

# metadata.dc.title[].value
Design, synthesis and biological evaluation of photoswitchable molecules targeting G protein-coupled receptors in retina