Steryl ester biosynthesis in plants

Abstract

[eng]Plant sterols are found in free form (free sterols, FS) and conjugated as steryl esters (SEs), steryl glucosides (SGs) and acylated steryl glucosides (ASGs). Conjugated sterols are ubiquitously found in plants, however their relative contents may differ among species. Specially, in genus Solanum plants, such as tomato, glycosylated sterols are found in a high amount, whereas in most plant species they are minor components. The SEs play a central role in the maintenance of homeostasis of membrane FS. The synthesis of SEs is catalyzed by sterol acyltransferases. Depending on the acyl donor substrate, sterol acyltransferases can be categorized into two main groups: acyl-CoA:sterol acyltransferases (ASAT) and phospholipid:sterol acyltransferases (PSAT). So far only ASAT and PSAT from Arabidopsis thaliana and tomato (S. lycopersicum) have been cloned and characterized. SlASAT localizes in the plasma membrane while AtASAT localizes in the endoplasmic reticulum. SlASAT and AtASAT share significant sequence identity but differ in length due to a central domain of 101 amino acids in SlASAT which has only 18 amino acids in the equivalent region of AtASAT. In this work, a strategy of overlapping extension PCR has been designed and implemented to obtain a chimeric cDNA encoding a hybrid ASAT in which the central domain of SlASAT has been replaced by the equivalent domain of AtASAT, as a first step to investigate the biological role of this ASAT protein domain. Moreover, a restriction fragment length polymorphism (RFLP) strategy has been devised and successfully applied to identify tomato homozygous knock-out mutants generated by CRISPR-Cas9.

[cat] Els esterols vegetals es troben en forma lliure (FS) i conjugada, com a esteril èsters (SEs), esteril glucòsids (SGs) i acil esteril glucòsids (ASGs). Els esterols conjugats són components àmpliament distribuïts en les plantes, però el seu contingut relatiu difereix entre les diferents espècies. En el gènere Solanum, com la tomaquera, els esterols glicosilats es troben en una proporció elevada, mentre que en la major part de les plantes són minoritaris. Els SEs tenen un paper rellevant en el manteniment de l'homeòstasi dels FS de membrana. La síntesi dels SEs està catalitzada per les esterol acil transferases. Depenent del substrat, aquestes es classifiquen en: acil-CoA:esterol acil transferases (ASAT) i les fosfolípid:esterol acil transferases (PSAT). Actualment, només les ASAT i PSAT d’Arabidopsis thaliana i tomaquera (S. lycopersicum) han estat clonades i caracteritzades. SlASAT es localitza a la membrana plasmàtica, en canvi, AtASAT es troba al reticle endoplasmàtic. Les seqüències d’SlASAT i AtASAT comparteixen una homologia significativa, però difereixen en longitud a causa del domini central de 101 aminoàcids d’SlASAT, el qual consta només de 18 aminoàcids en la regió equivalent d’AtASAT. En aquest treball, s’ha dissenyat i aplicat una estratègia d’extensió per PCR solapant per obtenir una seqüència de cDNA quimèrica que codifica per una proteïna ASAT híbrida, en la qual el domini central d’SlASAT ha estat reemplaçat pel domini equivalent d’AtASAT, com a un primer pas per a l’estudi d’aquest domini proteic. A més, s’ha ideat i aplicat una estratègia de polimorfisme de longitud dels fragments de restricció (RFLP) per identificar mutants knock-out de tomàquet de tipus homozigot generats mitjançant la tècnica CRISPR-Cas9.