COUPY coumarins as privileged scaffolds for the development of novel targeted fluorophores and metalbased PDT anticancer agents

Abstract

[eng] In this Thesis, we have explored the applications in cancer diagnosis and therapy of COUPY fluorophores, a new family of compounds based on the coumarin structure and operating in the far-red to near infrared region of the electromagnetic spectrum. The main goal of this research project was the development of novel far-red to NIR-emitting organic fluorophores based on the coumarin COUPY scaffold with enhanced photophysical and physicochemical properties for fluorescence imaging as well as to investigate their conjugation to receptor-binding peptides for tumor targeting, and to metal complexes for PDT applications. First, we have studied how the replacement of the para-pyridinium moiety in the COUPY fluorophores with several heterocycles (ortho-pyridine, ortho,ortho-pyrimidine and ortho,para-pyrimidine), partnering with different substituents at the 4 and 7-position of the coumarin scaffold, influences both the photophysical properties of the compound and the subcellular accumulation. Subsequently, COUPY fluorophores were successfully derivatized with suitable functional groups to allow their conjugation to peptides or other biomolecules, either via the formation of an amide bond or by a Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition reaction. In this manner, the octreotide peptide was easily and efficiently labeled with COUPY fluorophores following a stepwise Fmoc/tBu solid-phase peptide strategy, thus allowing us to visualize HeLa cells that overexpress somatostatin subtype 2 receptor. On the other hand, the second main objective of this Thesis was the development of novel PDT agents through conjugation of COUPY fluorophores to metal complexes, thus combining the excellent photophysical properties of COUPY dyes and the well-known anticancer activities of transition metal complexes. First, a cyclometalated Ir(III) complex was conjugated to a far-red-emitting coumarin. The Ir(III)–COUPY conjugate showed interesting properties for cancer phototherapy, including excellent cellular internalization, non dark cytotoxicity and excellent photocytotoxicity indexes after irradiation with green and blue light, even under hypoxia. Importantly, a clear correlation between cell death and intracellular generation of superoxide anion radicals (type I ROS) after visible light irradiation was demonstrated. Based on these good results, we synthesized four new Ir(III)-COUPY conjugates with the aim of establishing structure-activity relationships (SARSs). Mainly, we focused on investigating how the different modifications in the structure of the COUPY fluorophores influence the photophysical, photochemical and biological properties of the resulting photosensitizers. Finally, owing to the excellent biological and photophysical properties of Ru(II) polypyridyl complexes, a new conjugate between a COUPY fluorophore and a Ru(II) complex was synthesized to investigate its potential as a photodynamic therapy agent.

[spa] En esta Tesis doctoral se han abordado las posibles aplicaciones en diagnóstico y terapia del cáncer de una nueva familia de fluoróforos basados en cumarina, denominados COUPY, y que operan en la región del espectro electromagnético que va del rojo lejano al infrarrojo cercano. En primer lugar, se sintetizaron nuevos derivados de fluoróforos COUPY, reemplazando el fragmento para-piridina por diferentes heterociclos (orto-piridina y orto,orto- u orto,para- pirimidina), con el objetivo de establecer relaciones estructura-propiedad fotofísica, así como de estudiar su acumulación celular. Posteriormente, se derivatizaron satisfactoriamente con grupos funcionales adecuados para su conjugación a péptidos u otras biomoléculas, ya sea mediante la formación de un enlace amida o bien mediante una reacción de cicloadición azida- alquino catalizada por Cu(I). De esta forma, se marcó de forma fácil y eficiente en fase solida el péptido octreotide con fluoróforos COUPY, permitiéndonos así la visualización de células tumorales HeLa que sobreexpresan el receptor de somatostatina de tipo 2. Por otro lado, se diseñaron y sintetizaron nuevos agentes fotosensibilizadores para la terapia fotodinámica anticancerígena basados en la conjugación de fluoróforos COUPY a diferentes complejos metálicos. Así, en primer lugar, se llevó a cabo la síntesis y caracterización fotofísica, fotoquímica y biológica de un fotosensibilizador basado en un conjugado entre un complejo ciclometalado de Ir(III) y un fluoróforo COUPY con emisión en el rojo lejano. Este nuevo fotosensibilizador mostró características muy interesantes para la terapia fotodinámica, como son una excelente internalización celular, ausencia de citotoxicidad en la oscuridad y una elevada fototoxicidad tras irradiación con luz visible, tanto en normoxia como en hipoxia. Además, el conjugado Ir(III)-COUPY es capaz de generar radicales anión superóxido (ROS de tipo I) tras irradiación tanto con luz azul como con verde. En base a estos buenos resultados, se sintetizaron cuatro nuevos conjugados Ir(III)-COUPY con el objetivo de establecer relaciones estructura-actividad biológica. Principalmente, nos centramos en investigar cómo las diferentes modificaciones en la estructura de los fluoróforos COUPY influyen en las propiedades fotofísicas, fotoquímicas y biológicas de los fotosensibilizadores resultantes. Finalmente, se abordó la síntesis de un nuevo conjugado entre un fluoróforo COUPY y un complejo ciclometalado de Ru(II) tipo polipiridilo con el objetivo de estudiar su potencial como agente fotosensibilizador en terapia fotodinámica