Estudio de la modulación de los receptores adenosinérgicos como tratamiento complementario en la Fibrosis Quística

Abstract

[spa] La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva causada por variantes patogénicas en el gen Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR). La proteína resultante, también llamada CFTR, se expresa en varios tejidos epiteliales y confiere a la FQ un carácter multisistémico, siendo los aparatos respiratorio y digestivo los más afectados. La CFTR actúa como canal de Cl- y HCO3- tras su activación, iniciada gracias al aumento de los niveles de adenosín monofosfato cíclico (AMPc). Se han identificado más de 2.000 variantes patogénicas del gen CFTR, las cuales se clasifican en seis grupos (I-VI) según el tipo de alteración que provoca en la expresión y funcionalidad de la proteína. En la actualidad, el uso de fármacos específicos, conocidos como moduladores, ha supuesto un avance importante en el tratamiento de la enfermedad y ha permitido mejorar la calidad de vida de las personas afectadas por la FQ. Los moduladores son capaces de corregir la conformación de la proteína CFTR y/o potenciar su función. Se ha comprobado que la combinación de estos moduladores también resulta beneficiosa. Desde la aprobación del primer modulador en el 2012, se han aprobado tres nuevas combinaciones, la más reciente (2020) bajo el nombre de Kaftrio. Estos tratamientos están indicados para variantes patogénicas específicas del CFTR, lo que restringe su uso a determinados grupos de individuos. Además, se ha demostrado una variabilidad de respuesta al tratamiento, incluso entre individuos con el mismo genotipo. Esta situación subraya la necesidad de desarrollar terapias más específicas y eficaces que consideren el contexto genético y fenotípico de cada individuo. En enfermedades como la FQ, la medicina personalizada cobra especial relevancia, ya que es importante prever la respuesta a cada tipo de modulador para seleccionar el tratamiento más adecuado. El uso de modelos validados como los organoides intestinales, provenientes del epitelio rectal, permiten valorar la funcionalidad in vitro de la CFTR antes y después del tratamiento con moduladores. Este modelo celular, además, sirve como herramienta para explorar nuevas vías terapéuticas que mejoren la función de la CFTR. Este proyecto de tesis doctoral se ha enfocado en estudiar la modulación de los receptores adenosinérgicos (RAs) en organoides intestinales como un posible tratamiento complementario para la FQ, dado que los RAs regulan los niveles de AMPc. Por primera vez, se ha caracterizado la expresión de los cuatro subtipos de RAs (A1R, A2AR, A2BR y A3R) en organoides intestinales obtenidos de individuos control y de afectados por la FQ, destacando que el subtipo A2BR es el predominante en ambos grupos. Para poder evaluar la implicación de la vía de los RAs en la función de la CFTR en organoides intestinales, se adaptó y validó un ensayo funcional in vitro ampliamente utilizado en este modelo celular. Además, se demostró el papel del AMPc en la conexión entre ambas vías. Una vez establecido el ensayo funcional, se llevó a cabo un cribado de 20 compuestos antagonistas de los RAs en organoides intestinales control. Este proceso permitió, por un lado, la selección de dos compuestos antagonistas como candidatos para potenciar la función de la CFTR en organoides intestinales y, por otro lado, destacó la importancia del uso de agonistas de A2BR para mejorar la función de la CFTR. Finalmente, se evaluaron estos compuestos en organoides intestinales FQ. Los resultados de esta investigación doctoral demuestran que la combinación de agonistas de A2BR con el modulador del CFTR Kaftrio potencia el efecto del modulador, lo que resulta en un incremento significativo de la función de la CFTR en organoides intestinales FQ. En conjunto, los resultados presentados indican que los fármacos agonistas de A2BR pueden ser investigados para aplicarlos como complemento a las terapias actuales de la FQ.

[eng] Cystic Fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by pathogenic variants in the Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) gene. The resulting protein, also called CFTR, is expressed in various epithelial tissues and confers a multisystemic nature to CF, with the respiratory and digestive systems being the most affected. CFTR acts as a transporter for Cl- and HCO3- upon activation, initiated by increased cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels. Over 2,000 pathogenic variants of the CFTR have been identified and classified into six groups (I-VI) based on the type of alteration they cause in the expression and functionality of the protein. The introduction of specific drugs, referred to as modulators, represents a significant advancement in disease treatment and has led to improved quality of life for individuals with CF. Modulators can correct the conformation of the CFTR protein and/or enhance its function. Combining these modulators has also been found to be beneficial. Since the approval of the first modulator in 2012, three new combinations have been approved, with the most recent one (in 2020) named Kaftrio. These treatments are indicated for specific pathogenic variants of CFTR, thereby limiting their use to specific patient groups. Furthermore, variability in treatment response has been demonstrated even among individuals with the same genotype. This situation underscores the need to develop more precise and efficacious therapies that account for each individual's genetic and phenotypic context. In diseases like CF, personalized medicine becomes particularly relevant, predicting the response to each type of modulator for selecting the most suitable treatment. Validated models such as intestinal organoids, derived from rectal epithelium, allow for evaluating CFTR functionality in vitro before and after treatment with modulators. Additionally, this cellular model serves as a platform to explore new therapeutic pathways to enhance CFTR function. This doctoral thesis project has focused on studying the modulation of adenosinergic receptors (ARs) in intestinal organoids as a possible complementary treatment for CF, given that ARs regulate cAMP levels. For the first time, the expression of the four subtypes of ARs (A1R, A2AR, A2BR, and A3R) has been characterized in intestinal organoids obtained from control individuals and those affected by CF, highlighting that the A2BR subtype is predominant in both groups. A widely used in vitro functional assay in this cellular model was adapted and validated to assess the involvement of the AR pathway in CFTR function in intestinal organoids. Additionally, the role of cAMP in connecting both pathways was demonstrated. Once the functional assay was established, 20 AR antagonist compounds were screened in control intestinal organoids. This process allowed the selection of two antagonist compounds as candidates to enhance CFTR function in intestinal organoids, and also emphasized the importance of using A2BR agonists to improve CFTR function. Finally, these compounds were evaluated in CF organoids. The results of this doctoral research demonstrate that combining A2BR agonists with the CFTR modulator Kaftrio enhances the modulator's effect, resulting in a significant increase in CFTR function in CF intestinal organoids. Taken together, the presented results indicate that A2BR agonist drugs can be investigated for application as a complement to current CF therapies.