Expresión génica y regulación transcripcional de los genes "nrd" en bacterias

Abstract

[spa] A lo largo de la historia, el ser humano ha estado en contacto con el mundo microbiano, y un claro ejemplo de ello son las bacterias, causantes de diversas enfermedades infecciosas, aunque en otras ocasiones beneficiosas para nuestro organismo. El descubrimiento de los antibióticos marcó un hito en el tratamiento de estas infecciones, constituyendo la primera revolución en el tratamiento de las mismas. Sin embargo, en la actualidad, se hace cada vez más imperativo el desarrollo de nuevas metodologías para abordar y estudiar diferentes microorganismos patógenos, dado que estos pueden generar resistencia a los antibióticos disponibles. Aunque las nuevas generaciones de antibióticos son más sofisticadas y efectivas, están surgiendo bacterias multirresistentes que pueden evadir casi cualquier tipo de tratamiento antibiótico, lo que representa un gran desafío para la salud pública y la medicina moderna. En este contexto, se buscan nuevas alternativas que actúen en dianas antimicrobianas diferentes a los antibióticos convencionales. Por lo tanto, se requiere una comprensión a nivel molecular de los patógenos bacterianos para diseñar terapias dirigidas a objetivos moleculares previamente desconocidos o distintos de los abordados por los antibióticos actuales. Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa multirresistente que codifica en su genoma las ribonucleótido reductasas (RNRs), enzimas encargadas de suministrar los desoxirribonucleótidos (dNTPs) necesarios para la síntesis y reparación del ADN. Estas enzimas se han considerado como dianas antimicrobianas en estudios recientes. Aunque en eucariotas sólo se encuentra codificada la RNR de clase Ia, eubacterias como P. aeruginosa, presentan las tres clases de RNR (clase I, II y III), lo que le confiere una gran versatilidad para adaptarse a diferentes ambientes, ya que cada clase tiene unas características que favorecen su actividad en diversas condiciones ambientales. En las últimas décadas, se han identificado varios factores transcripcionales que regulan la expresión génica de las RNR. Uno de estos factores es NrdR, capaz de reprimir todas las clases de RNR, aunque su regulación es incierta. Además, P. aeruginosa tiene capacidad de formar biopelículas o biofilms, donde suele haber un gradiente en la concentración de oxígeno, por lo que es interesante ver cómo puede cambiar la expresión génica de múltiples genes de forma simultánea. En este estudio, nos proponemos profundizar en el conocimiento de la expresión génica y la regulación transcripcional de los genes nrd en bacterias. Por un lado, buscamos los factores transcripcionales asociados a la regulación de la expresión génica del gen regulador de las RNR, nrdR. Hemos demostrado que FleQ regula el gen nrdR al unirse a la caja de unión FleQ Box bajo diferentes condiciones oxigénicas (aeróbicas y anaeróbicas) y durante la formación de biofilm bacteriano.

También evaluamos el papel de FleQ durante la infección en el modelo in vivo de Galleria mellonella. Además, hemos desarrollado un sistema que combina el uso de un casete sintético llamado GLOW, que codifica para proteínas fluorescentes como genes reporteros, con plásmidos que pueden permanecer en el citoplasma de la bacteria o insertarse cromosómicamente en el genoma bacteriano. Probamos este sistema en diferentes condiciones comúnmente descritas en la expresión génica en bacterias, utilizando para ello los promotores génicos de las distintas RNRs de P. aeruginosa estudiados en nuestro laboratorio, obteniendo resultados similares a los previamente obtenidos y corroborando la utilidad de nuestro sistema. En conclusión, el entendimiento de la regulación transcripcional del gen nrdR es fundamental y se encuentra un poco más completo gracias a al papel que efectúa el factor transcripcional FleQ. Además, demostramos que el sistema de plásmidos que contiene el casete GLOW es una herramienta efectiva y fácil para estudiar simultáneamente varios genes bacterianos mediante proteínas fluorescentes bajo condiciones ambientales dinámicas.

[eng] Throughout history, humans have been in constant contact with the microbial world. Bacteria, for example, are the causative agents of various infectious diseases, but in other cases, they can be beneficial to our organism. The discovery of antibiotics marked a milestone in the treatment of these infections, constituting the first revolution in their management. However, nowadays, the development of new methodologies to address and study different pathogenic microorganisms is becoming increasingly imperative, as these can generate resistance to available antibiotics. Although new generations of antibiotics are more sophisticated and effective, multidrug-resistant bacteria are emerging that can evade almost any type of antibiotic treatment, posing a major challenge to public health and modern medicine. In this context, new alternatives are being sought that act on antimicrobial targets different from conventional antibiotics. Therefore, a molecular-level understanding of bacterial pathogens is required to design targeted therapies aimed at previously unknown or distinct molecular targets from those addressed by current antibiotics. Pseudomonas aeruginosa is a multidrug-resistant Gram-negative bacterium that encodes ribonucleotide reductases (RNRs) in its genome. RNRs are enzymes responsible for supplying the deoxynucleotides (dNTPs) necessary for DNA synthesis and repair. These enzymes have been considered as antimicrobial targets in recent studies. While eukaryotes only encode class Ia RNR, eubacteria such as P. aeruginosa present the three classes of RNR (class I, II, and III), which gives them great versatility to adapt to different environments, as each class has characteristics that favor their activity under diverse environmental conditions. In recent decades, several transcription factors have been identified that regulate the gene expression of RNRs. One of these factors is NrdR, capable of repressing all classes of RNR, although its regulation is uncertain. In addition, P. aeruginosa has the ability to form biofilms, where there is often an oxygen concentration gradient, so it is interesting to see how the gene expression of multiple genes can change simultaneously. In this study, we propose to deepen our understanding of the gene expression and transcriptional regulation of nrd genes in bacteria. On the one hand, we are looking for the transcription factors associated with the regulation of gene expression of the RNR regulator gene, nrdR. We have shown that FleQ regulates the nrdR gene by binding to the FleQ Box under different oxygen conditions (aerobic and anaerobic) and during bacterial biofilm formation. We also evaluated the role of FleQ during infection in the Galleria mellonella in vivo model. In addition, we have developed a system that combines the use of a synthetic cassette called GLOW, which encodes fluorescent proteins as reporter genes, with

plasmids that can remain in the bacterial cytoplasm or be chromosomally inserted into the bacterial genome. We tested this system under different conditions commonly described in gene expression in bacteria, using for this purpose the gene promoters of the different P. aeruginosa RNRs studied in our laboratory, obtaining results similar to those previously obtained and corroborating the usefulness of our system. In conclusion, understanding the transcriptional regulation of the nrdR gene is fundamental and is now a little more complete thanks to the role played by the transcription factor FleQ. In addition, we demonstrate that the plasmid system containing the GLOW cassette is an effective and easy tool for simultaneously studying several bacterial genes using fluorescent proteins under dynamic environmental conditions.