New visible-light activated caging groups based on COUPY dyes for anticancer phototherapeutic applications

Abstract

[eng] This doctoral thesis has addressed the study of several therapeutic applications against cancer of a new family of photolabile protective groups (PPGs) based on COUPY coumarins, photoactivated with visible light. First, the effect of introducing a methyl group in a position adjacent to the photolabile bond in the coumarin skeleton was investigated, to evaluate how the formation of a secondary carbocationic intermediate influences the efficiency of the photolysis process. The sequential deprotection of two coumarin-protected functionalities within the same reaction medium was successfully achieved by stepped irradiation using visible light compatible with biological systems. This was carried out first by irradiating with red light to selectively deprotect the coumarin-based PPG COUPY, followed by irradiation with green light to activate the dicyanocoumarin-based PPG. The impact of replacing the pyridine group with a pyrimidine group was also studied, as well as the effect of modifying the outgoing group. The mitochondrial accumulation of COUPY photolabile compounds was confirmed by confocal microscopy in HeLa cells, thus demonstrating that the photoactivation of protected derivatives of 2,4-dinitrophenol takes place specifically in this organelle. Subsequently, the replacement of the methyl group by a phenyl group was explored as a strategy to further stabilize the carbocationic intermediate and improve the efficiency of the photodeprotection process, resulting in COUPY and dicyanocoumarin derivatives with slightly faster photolysis. Secondly, the ability of COUPY coumarin-based PPGs to release biologically active compounds into the mitochondrion was investigated. Specifically, the derivatives of the antitumor agents chlorambucil (CLB) and 4-phenylbutyric acid (4-PBA) showed remarkable phototoxicity in cancer cells after irradiation with green-yellow light, with IC50 values in the nanomolar range. This effect is attributed to a synergy between the release of the drug and the generation of reactive oxygen species (ROS) by coumarin. These results highlight the potential of COUPY coumarin-based PPGs as anticancer agents combining photodynamic therapy (PDT) and photoactivated chemotherapy (PACT). Finally, taking advantage of their activation with visible light, the COUPY derivatives were functionalized with 2,2'-bipyridine, which allowed their incorporation into

polypyridyl Ru(II) complexes. Two Ru-COUPPY complexes were synthesized, capable of releasing the antitumor drugs CLB and 4-PBA both under irradiation with green-yellow light and red light in a few minutes with improved photoefficiency compared to PPGs based on COUPY coumarins. Ru-COUBPY complexes show outstanding photocytotoxic activity against CT-26 cancer cells, both under normoxia and hypoxia conditions, with efficacy in the nanomolar range. In addition, they have excellent stability in the dark in culture medium, as well as a high photostability of the resulting photoproduct, which makes them very promising candidates for applications in next-generation anticancer photodynamic therapies. These Ru-coumarin complexes act as dual anticancer agents: they generate reactive oxygen species (ROS) via PDT and, simultaneously, release antitumor drugs through PACT. Therefore, Ru-COUBPY complexes that can be activated with red light represent an innovative and effective alternative to conventional cancer therapies.

[cat] En aquesta tesi doctoral s’ha abordat l’estudi de diverses aplicacions terapèutiques contra el càncer d’una nova família de grups protectors fotolàbils (PPGs) basats en cumarines COUPY, fotoactivables amb llum visible. En primer lloc, es va investigar l'efecte d'introduir un grup metil en una posició adjacent a l'enllaç fotolàbil a l'esquelet de cumarina, per avaluar com la formació d’un intermedi carbocatiònic secundari influeix en l'eficiència del procés de fotòlisi. La desprotecció seqüencial de dues funcionalitats protegides amb cumarina dins del mateix medi de reacció es va aconseguir amb èxit mitjançant una irradiació escalonada utilitzant llum visible compatible amb sistemes biològics. Això es va dur a terme primer irradiant amb llum vermella per desprotegir selectivament el PPG basat en cumarina COUPY, seguidament d'una irradiació amb llum verda per activar el PPG basat en dicianocumarina. També es va estudiar l’impacte de substituir el grup piridini per un grup pirimidini, així com l’efecte de modificar el grup sortint. L’acumulació mitocondrial dels compostos fotolàbils COUPY va ser confirmada mitjançant microscòpia confocal en cèl·lules HeLa, demostrant així que la fotoactivació dels derivats protegits de 2,4- dinitrofenol té lloc específicament en aquest orgànul. Posteriorment, es va explorar la substitució del grup metil per un grup fenil com a estratègia per estabilitzar encara més l’intermedi carbocatiònic i millorar l’eficiència del procés de fotodesprotecció, donant lloc a derivats COUPY i de dicianocumarina amb una fotòlisi lleugerament més ràpida. En segon lloc, es va investigar la capacitat dels PPGs basats en cumarines COUPY per alliberar compostos biològicament actius al mitocondri. Concretament, els derivats dels agents antitumorals clorambucil (CLB) i àcid 4-fenilbutíric (4-PBA) van mostrar una notable fototoxicitat en cèl·lules canceroses després de la irradiació amb llum verd-groga, amb valors d’IC50 en el rang nanomolar. Aquest efecte s’atribueix a una sinergia entre l’alliberament del fàrmac i la generació d’espècies reactives d’oxigen (ROS) per part de la cumarina. Aquests resultats destaquen el potencial dels PPGs basats en cumarines COUPY com a agents anticancerígens que combinen teràpia fotodinàmica (PDT) i quimioteràpia fotoactivada (PACT). Finalment, aprofitant la seva activació amb llum visible, els derivats COUPY es van funcionalitzar amb 2,2’-bipiridina, cosa que va permetre la seva incorporació a

complexos de Ru(II) de tipus polipiridil. Es van sintetitzar dos complexos Ru-COUBPY, capaços d'alliberar els fàrmacs antitumorals CLB i 4-PBA tant sota irradiació amb llum verd-groga com amb llum vermella en pocs minuts amb una millorada fotoeficiència respecte als PPGs basats en cumarines COUPY. Els complexos Ru-COUBPY mostren una destacada activitat fotocitotòxica contra les cèl·lules canceroses CT-26, tant en condicions de normòxia com d’hipòxia, amb una eficàcia en el rang nanomolar. A més, presenten una excel·lent estabilitat en la foscor en medi de cultiu, així com una gran fotoestabilitat del fotoproducte resultant, fet que els converteix en candidats molt prometedors per a aplicacions en teràpies fotodinàmiques anticancerígenes de nova generació. Aquests complexos Ru-cumarina actuen com a agents anticancerígens duals: generen espècies reactives d’oxigen (ROS) mitjançant PDT i, simultàniament, alliberen fàrmacs antitumorals a través de PACT. Per tant, els complexos Ru-COUBPY activables amb llum vermella representen una alternativa innovadora i eficaç a les teràpies convencionals contra el càncer.