Caracterització funcional del factor GAGA de "Drosophila melanogaster"

Abstract

[cat] La proteïna GAGA de Drosophila melanogaster, codificada pel gen Trithorax-like (Trl) , és una proteïna ubiqua que presenta gran varietat de funcions. GAGA és capaç d'activar un elevat nombre de gens i s'ha vist que pot reprimir al gen que la codifica mitjançant un mecanisme d'autoregulació negativa. En aquest treball hem indagat sobre el mecanisme d'activació de GAGA mirant la relació d'aquesta amb la maquinària general de transcripció. Mitjançant immunolocalitzacions en cromosomes politènics hem observat una elevada col·localizació de GAGA amb l'RNA polimerasa II i amb diferents TAFs del complex TFIID: TAF1, TAF3 i TAF4. Realitzant coimmunoprecipitacions sobreexpressant GAGA i TAF3-HA, a cèl·lules S2, hem demostrat la interacció in vivo de GAGA amb TAF3. Assajos de pull down suggereixen que els dominis X i DBD de GAGA poden estar implicats en la interacció d'aquestes dues proteïnes. Per altra banda, el mateix assaig de coimmunoprecipitació sobreexpresant GAGA i TAF4-HA demostra la interacció in vivo de GAGA amb TAF4 i mitjançant coimmunoprecipitacions sobreexpresant construccions delecionades de GAGA es demostra que ni el domini Q, ni el domini POZ de GAGA són imprescindibles per aquesta interacció. S'ha buscat una possible repercussió biològica d'aquests dos TAFs sobre el mecanisme d'activació de GAGA per veure si aquests TAFs poden actuar com a coactivadors de GAGA. Assajos de transfecció transitòria sobreexpressant a cèl·lules S2 quantitats constants de GAGA i quantitats creixents de TAF3-HA y TAF4-HA no han permès veure cap efecte coactivador d'aquests TAFs sobre GAGA en el context de diferents promotors. Està descrit que el motiu LxxLL en insectes és un possible motiu d'unió de factors de transcripció a TAF4. En aquest treball hem identificat dos d'aquests motius LxxLL en el domini POZ de GAGA. Mitjançant transfeccions transitòries hem vist que mutacions de residus no essencials en aquest motiu LxxLL no afecten la capacitat activadora ni repressora de la proteïna i que al transfectar aquestes proteïnes mutades s'observa una quantitat similar de proteïna que quan es transfecta la proteïna salvatge. Contràriament, diferents mutacions en una leucina essencial del motiu LxxLL, concretament la leucina 87 (L87), generen una proteïna GAGA defectiva en activació i totalment funcional en repressió. Al transfectar aquests mutants, es detecta GAGA en menor quantitat que al sobreexpressar GAGA salvatge. Paral·lelament, en un sistema heteròleg (cèl·lules HeLa) tot i que s'ha vist que el mutant L87D sí que presenta nivells de proteïna similars als de la proteïna salvatge, tampoc és capaç d'activar correctament suggerint que a cèl·lules S2 la proteïna podria ser detectada com a defectiva en activació i, per tant, ser degradada ràpidament. Així, es pot afirmar que el residu L87 és un residu important per la capacitat activadora de GAGA. S'ha observat que la sobreexpressió de GAGA en embrions i discos imaginals de larves en tercer estadi no altera els patrons d'expressió d' Ultrabithorax, engrailed i even-skipped . La sobreexpressió no és capaç d'obrir finestres d'expressió per aquests gens en dominis on normalment no s'expressen. La depleció de GAGA a disc imaginal tampoc afecta l'expressió d' engrailed ni Ultrabithorax , gens que sí es veuen alterats en mutants genètics de Trl. El fet que ni la sobreexpressió ni la depleció de GAGA a disc imaginal alteri aquests gens suggereix que GAGA no deu ser important per aquests gens a nivell larvari. Assajos derivats de microarrays de sobreexpressió i falta de funció de GAGA a disc imaginal de larva en tercer estadi suggereixen la implicació de GAGA en processos que, pendents de confirmació, ampliarien encara més el ventall de les múltiples funcions ja conegudes del factor GAGA, que es confirma com a factor activador de la transcripció de múltiples gens a Drosophila .

[eng] The GAGA factor is an essential protein of "Drosophila melanogaster" encoded by the "Trithorax-like" (Trl) gene. GAGA is a multifunctional and ubiquitous protein which is able to activate an important number of genes and can repress its own expression. In this work we have looked at the activation mechanisms of GAGA factor by checking the relationship of GAGA with the general transcription machinery. Immunolocalizations in polytene chromosomes have demonstrated a significant colocalization of GAGA with the RNA polymerase II and with different TAFs of the TFIID complex: TAF1, TAF3 and TAF4. Additionally, coimmunoprecipitation assays have demonstrated an in vivo interaction of GAGA with TAF3 and TAF4. To go further, we have used different strategies to search a possible biological repercussion of the physical interaction of GAGA with these two TAFs. Besides, we have seen that GAGA overexpression in embryos or imaginal discs of third instar larvae do not affect the endogenous expression pattern of "Ultrabithorax", "engrailed" or "even-skipped". Thus, it is not possible to open windows of expression of these genes out of its own expression domains by GAGA overexpression. Depleting GAGA in imaginal discs does not alter the expression of engrailed or "Ultrabithorax" either, although they are altered in conventional genetic GAGA mutants. The fact that neither the overexpression nor the depletion of GAGA in imaginal disc affects the expression of those genes suggests that GAGA might not be important for their regulation at a larval level. Finally, microarray assays overexpressing or depleting GAGA in wing imaginal discs of third instar larvae suggest new roles for GAGA that increase the multiple well known functions of GAGA, and confirm once again that GAGA is an activator factor of multiple "Drosophila" genes.