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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)

URI permanent per a aquesta col·leccióhttps://hdl.handle.net/2445/36237

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    Anàlisi genètica i molecular de la síndrome de Down. Aïllament de gens a la regió cromosòmica 21q22.2-q22.3: identificació i caracterització del gen Minibrain (MNBH)
    (Universitat de Barcelona, 1988-11-03) Guimerà i Vilaró, Jordi; Pritchard, Melanie; Estivill, Xavier, 1955-; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [cat] Aquest treball està emmarcat dins la línia d'investigació sobre el cromosoma 21 humà i la síndrome de Down que el Centre de Genètica Mèdica i Molecular duu a terme i de la qual aquesta tesi en forma part. La síndrome de Down s'ha d'estudiar com una patologia genètica complexa, potser la més complexa de les que es coneixen en humans. Aquesta tesi està estructurada en set parts ben diferenciades. En la primera tracto els aspectes característics i generals de la síndrome de Down. En la segona presento els objectius que van motivar el treball d'aquesta tesi. En la tercera part descric detalladament els materials i mètodes emprats, a fi i efecte de permetre la realització de cadascuna de les tècniques presentades i la reproducció dels resultats mostrats. En la quarta recopilo els resultats dels treballs presentats en forma de publicacions. En la cinquena part presento un resum dels resultats i la seva discussió i es dóna pas a l’apartat de les conclusions del treball científic. La setena i darrera part de la memòria presentada conté la informació bibliogràfica referenciada. He intentat, de manera més o menys encertada, trobar aquella traducció al català més correcta de cadascun dels mots tècnics propis del llenguatge científic, ja que en el procés d'incorporació de terminologia al català s'han produït força vacil·lacions. Tanmateix, s'ha conservat la denominació original en cursiva. L'única finalitat d'aquest manlleu lèxic (bàsicament llatinismes i anglicismes) ha estat la de facilitar la comprensió del text. Tenint com a horitzó aquest mateix objectiu i per tal d'establir una regularitat i una coherència entre la presentació de les sigles acronímiques que apareixen en els articles publicats en anglès i aquelles que apareixen en els diferents apartats de la tesi, he preferit conservar l'ordre de les inicials de les sigles emmanllevades. D'aquesta manera, referint-se a la síndrome de Down trobarem DS i no SD. Finalment, he volgut no duplicar la descripció dels resultats en els diferents apartats d'aquesta memòria, de manera que en l'apartat de resum i discussió he posat l'accent en aquells resultats que no s'han escaigut en l'apartat de resultats dels articles publicats, però que per la seva importància, per facilitar i ampliar la comprensió dels resultats presentats, he cregut adequat presentar-los.
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    Regulació del transportador de glucosa GLUT1 en cèl·lules endotelials i musculars
    (Universitat de Barcelona, 1996) Viñals Canals, Francesc; Zorzano Olarte, Antonio; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] En respuesta a elevadas concentraciones de glucosa en el medio, las células endoteliales ECV304 no sufren modificaciones en el transporte de glucosa, pero sí en la actividad de la enzima hexoquinasa. La enzima PI3K está implicada tanto en la estimulación por la insulina del transporte de glucosa, como en el trafico intracelular de GLUT1 en mioblastos SOL8. Tanto las células musculares SOL8 como las L6E9 presentan una transición en la expresión de transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT4 durante la diferenciación de mioblastos a miotubos. La diferenciación reprime la actividad transcripcional de un fragmento de 2240 PB del promotor de GLUT1. Este efecto se debe a modificaciones en los 33 PB situados a 5' del origen de transcripción y en el fragmento situado entre -99 y -33. La diferenciación de las células L6E9 y la sobrexpresión de MYOD conducen a la represión de la expresión del factor de transcripción SP1 y a la eliminación de la formación de complejos en un elemento SP1 Localizado en el fragmento -99/-66 del promotor de GLUT1.
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    Interacción funcional entre la adenosina desaminasa y el receptor A1 de adenosina en la superficie celular
    (Universitat de Barcelona, 1998-01-14) Saura Antolín, Carlos A. (Carlos Alberto); Canela Campos, Enric I. (Enric Isidre), 1949-; Franco Fernández, Rafael; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] La adenosina deaminasa (ADA) es una enzima del metabolismo purínico que ha sido hallada tanto en el citosol como en la superficie celular. En este estudio se ha demostrado que la ADA interacciona con los receptores A1 de adenosina (A1Rs) en corteza cerebral de cerdo y en la línea celular DDT1MF-2. A través de esta interacción la ADA aumenta la afinidad del receptor A1 por los ligandos agonistas, permite la aparición del estado de alta afinidad del receptor (receptor-proteína G) y es necesaria para la correcta transducción de la señal del receptor A1. Los mecanismos moleculares involucrados en la desensibilización homóloga de los A1Rs se estudiaron en células DDT1MF-2. La exposición crónica de las células con el agonista R- PIA produce una rápida desensibilización funcional, la fosforilación y la agregación en la superficie celular de los receptores A1. La internalización de los A1Rs hacia compartimentos intracelulares es un proceso lento (horas) y conduce a la “down-regulation” de éstos. El antagonista, por el contrario, induce la aparición de nuevos centros de unión en la membrana. Todos los procesos implicados en la desensibilización homóloga del receptor A1 son acelerados y aumentados por la ADA. El agonista induce también la internalización conjunta de la ADA y los A1Rs. Estos resultados muestran una regulación mutua y una vía de endocitosis común de la ADA y el A1R de adenosina durante el proceso de desensibilización. Este es el primer estudio donde se demuestra que un miembro de la familia de receptores acoplados a proteína G requiere una ectoenzima, cuyo sustrato es el ligando del receptor, para una eficiente señalización y regulación funcional.
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    Pegilació i vehiculització mitjançant anticossos, de liposomes i d'adenovirus: aplicació a la transferència gènica i al transport de citostàtics
    (Universitat de Barcelona, 2002-07-23) Carrión Ribas, Carme; Domingo i Pedrol, Joan Carles; Madariaga de las Heras, M. África de; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] El Polietilenglicol (PEG) es una molécula de gran interés, ya que es capaz de prolongar el tiempo de residencia en sangre de muchas moléculas, como las proteínas, los oligonucleótidos, los liposomas o los adenovirus. En el transcurso del trabajo de esta tesis doctoral se ha estudiado la aplicación del PEG en tres ámbitos distintos: la incorporación del PEG a liposomas mediante su unión al colesterol (Chol), la incorporación del PEG a inmunoliposomas que encapsulan Doxorubicina (Dox) y finalmente, la unión del PEG a adenovirus, a los que, a la vez, se ha incorporado anticuerpos monoclonales (AcMo). - APLICACIÓN DE DERIVADOS PEGILADOS DE COLESTEROL EN SISTEMAS LIPOSOMALES Se ha optimizado la síntesis de dos derivados pegilados del colesterol, en concreto el Chol-PEG, derivado en el que el Chol se une directamente al PEG mediante un enlace carbamato, y el Chol-L-PEG, molécula en la que el Chol no se une directamente al PEG sino mediante una barra espaciadora de 6 átomos. El Chol-PEG es menos eficiente que el Chol-L-PEG y genera defectos en las membranas a las que se incorpora. Ambos derivados son capaces de mantener la capacidad antigénica de los AcMo que se unen al extremo del PEG y permiten direccionar los liposomas hacia tejidos concretos. - TOXICIDAD IN VITRO DE INMUNOLIPOSOMALES (SIL) ANTI-CD34 Y ANTI-EGFr QUE ENCAPSULAN DOX La encapsulación de la Dox en SIL permite dirigir los efectos de este fármaco de forma específica. Los AcMo utilizados han sido el My10, que reconoce el antígeno CD34, y el 425, que se une al EGFr. El CD34 nos ha permitido comprobar la eficiencia de los SIL en un modelo de tumores circulantes, en el que la interacción del Ac con el antígeno no va seguida de la endocitosis del complejo. En este caso los SIL tienen el mismo efecto citotóxico que la Dox libre, pero permiten dirigirla específicamente. Por su parte, el EGFr, nos ha servido como diana representativa de los tumores sólidos.
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    Factor 4 Plaquetar indueix activitat proinflamadora en les cèl·lules "Natural Killer" Humanes, El
    (Universitat de Barcelona, 2004-06-21) Bertran Rodríguez, Esther; Rueda, Fèlix, 1951-; Viñas i Folch, Octavi; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [cat] L'activació de les plaquetes en resposta a la lesió vascular o la inflamació porta a la secreció de gran nombre de mediadors els quals són capaços de modular les funcions de les cèl·lules implicades en la Inflamació. El F4P (Factor 4 Plaquetar) és una proteïna específica de les plaquetes i membre de la superfamilia de proteïnes anomenades quemoquines. Encara que estan força establertes l'activitat del F4P com a efector antiangiogènic i procoagulant, es coneix poc sobre la seva implicació en la regulació de la Inflamació. En aquest estudi es demostra la capacitat del F4P per estimular les anomenades cèl·lules "Natural Killer" a sintetitzar citoquines proinflamatòries com són la IL-8, IL-1beta, IL-6, INF-gamma, TNF-alfa i GM-CSF. Assaigs de cinètica i de dosi resposta (10-200 ng/ml) es demostren que el F4P incrementa els nivells de mRNA i proteïna de totes les citoquines estudiades. Es va determinar la capacitat del F4P per induir aquest efecte unit a heparansulfats, ja que en condicions fisiològiques el F4P es troba unit als glicosaminoglicans de la paret vascular. Els resultats obtinguts posen de manifest que el F4P, en aquestes condicions, manté la capacitat d'activar les cèl·lules NK. L'estimulació d'aquestes cèl·lules a través del receptor Fc-gamma-RIIIA (CD16) provoca un efecte d'increment sinèrgic amb el F4P en el lliurament de citoquines. En canvi no vàrem observar cap efecte del F4P sobre cèl·lules NK primàries en repòs en aquelles activitats regulades per la IL-2 com son les activitats citotòxiques "Natural Killer" NK, "Lymphokine-Activated Killer" LAK ó l'expressió del receptor IL-2R (CD25). En canvi el F4P es capaç d'induir un increment dosi-resposta en la "antibody-dependent cellular cytotoxicity" ADCC, activitat citotóxica no regulada, en aquestes condicions, per la IL-2. A més a més, el F4P incrementa l'expressió de CD69, demostrant la inducció d'un estat d'activació. Les cèl·lules NK estimulades amb F4P lliuren citoquines amb capacitat per desencadenar el quimiotactisme dels neutròfils. El 70% d'aquest potencial quimiotàctic induït pels factors lliurats per les cèl·lules NK estimulades amb F4P, es deu a la IL-8 lliurada per aquestes cèl·lules. Es va iniciar l'estudi del possible mecanisme de transducció de senyal desencadenat pel F4P en les cèl·lules NK. Per això es va tenir en compte que el F4P pertany a la família de proteïnes anomenada quemoquines. La major part de les proteïnes d'aquesta família interaccionen amb receptors de 7 segments de domini transmembrana acoblats a proteïnes G i amb el Ca2+ com a missatger secundari. Per poder valorar la possible implicació d'un receptor d'aquestes característiques pel F4P, es va determinar per un costat l'augment transitori de Ca2+ així com la implicació de les proteïnes G. Els resultats que vàrem obtenir ens demostren que l'activitat del F4P sobre aquestes cèl·lules no s'associa a un increment transitori de Ca2+ i cap dels inhibidors de proteïnes G testats va revertir l'efecte del F4P. En canvi, vàrem poder associar l'estímul del F4P a l'activació d'enzims fosfo-tirosinquinasa i més concretament a la fosforilació en residus tyr de l'enzim PI3-K. Per altre banda, els resultats obtinguts amb inhibidors de la transcripció, per una banda, i de la traducció per l'altre apunten que el F4P indueix la síntesi de citoquines estimulant la seva transcripció génica. Finalment, els resultats suggereixen l'existència en les cèl·lules NK de dues vies complementàries i contraposades que semblen bloquejar-se mútuament dirigint l'activitat d'aquestes cèl·lules vers un comportament citolític ó pro-inflamatori. Amb aquests resultats evidenciem, per tant, una nova capacitat pel F4P en potenciar la resposta pro-inflamatòria a través de les cèl·lules Natural Killer. Una de les funcions menys conegudes d'aquestes cèl·lules.
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    Factores de transcripción en el desgaste muscular asociado a la caquexia
    (Universitat de Barcelona, 2004-11-04) Moore Carrasco, Rodrigo Ernesto; Busquets Rius, Sílvia; López-Soriano, Francisco J.; Argilés Huguet, Josep Ma.; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] La caquexia es un síndrome frecuentemente asociado al crecimiento tumoral, así como también a otros estados patológicos como son sepsis, SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida), diabetes, etc. La caquexia se caracteriza por una importante y progresiva pérdida de peso corporal debida principalmente a la desaparición de las reservas de grasa y a la disminución de masa muscular. Está acompañada también de anorexia, náuseas, astenia, debilidad, alteración de la homeostasis hormonal e inmunodepresión. Sobre los factores de transcripción que podrían estar involucrados en el proceso de desgaste muscular observado en la caquexia ( in vivo ), se sabe muy poco, pero aparecen algunos factores como posibles candidatos tanto en el desencadenamiento como en la regulación de este proceso. NF-kappa-B y AP-1 son dos factores de transcripción que están activados en distintos tejidos en procesos inflamatorios. Se ha descrito que NF-kappa-B y AP-1 tienen una regulación diferencial en músculo esquelético de rata durante el proceso de sepsis. El mismo grupo ha determinado que C/EBP, otro factor de transcripción involucrado en el proceso de inflamación, aumenta su actividad de unión al DNA en músculo de ratas sépticas, y que este proceso es dependiente de glucocorticoides. Los objetivos de este estudio son: 1) analizar la regulación de algunos factores de transcripción en el músculo esquelético durante la caquexia inducida por el crecimiento tumoral. 2) revertir el desgaste muscular asociado al crecimiento tumoral mediante estrategias basadas en factores de transcripción desde un punto de vista farmacológico. 3) aproximaciones a una terapia contra la caquexia mediante un adenovirus para la transferencia génica de un dominante negativo de AP-1. Los resultados obtenidos nos permiten concluir que el factor de transcripción AP-1 presenta una regulación diferencial en el músculo esquelético durante el crecimiento tumoral, lo que sugiere que este factor está implicado en el desarrollo de la caquexia asociada al cáncer. Por el contrario, otros factores de transcripción estudiados (NF-kappa-B, C/EBP y Sp-1) no parecen estar implicados directamente en el desarrollo del proceso caquéctico, al menos a nivel muscular. El factor miogénico MyoD presenta importantes cambios en sus niveles en el músculo esquelético de diferentes modelos experimentales de tumores caquécticos, así como en el músculo de pacientes con cáncer de páncreas. La administración aguda de LPS a ratas también afecta marcadamente los niveles musculares de MyoD. Estos datos sugieren una implicación de dicho factor en el desarrollo de la caquexia asociada al crecimiento tumoral y otros procesos patológicos. La administración de SP100030, inhibidor de NF-kappa-B y AP-1, logra revertir parcialmente los efectos asociados al crecimiento del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Este efecto está asociado a una inhibición de la actividad de unión de AP-1 al DNA, un aumento en la expresión de MyoD, y una disminución en la proteólisis muscular. El tratamiento con GW1929, agonista de PPAR-gamma, induce una recuperación en el peso de los músculos extensor digitorum longus de ratones portadores de carcinoma pulmonar de Lewis, asociado a un restablecimiento de los niveles de MyoD. Este compuesto también induce una disminución en la proteólisis de estos músculos in vitro . La sobreexpresión de Tam67, dominante negativo de AP1, revierte totalmente los efectos causados por la adición de TNF-alfa al medio de cultivo de mioblastos C2C12 en diferenciación. Este efecto es producido por el restablecimiento del programa de diferenciación muscular, mediado por una disminución de ciclina D1, una recuperación de los niveles de MyoD y un aumento de la proteína MHC en estas células. La transferencia génica in vivo de dominante negativo de AP-1 Tam67 mediante adenovirus, produce una recuperación en el peso de los músculos y una atenuación en la caída de los niveles de MyoD en el músculo gastrocnemius de animales portadores de tumor.
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    Biosíntesis de mediadores lipídicos derivados de la 5-lipooxigenasa en el sinusoide hepático. Implicaciones en la fibrogénesis hepática.
    (Universitat de Barcelona, 2004-07-21) Titos Rodríguez, Esther; Clària i Enrich, Joan; López-Soriano, Francisco J.; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] La fibrosis hepática es el resultado de un proceso inflamatorio y de reparación de tejido en respuesta a un daño hepático prolongado y se define como la acumulación de tejido conectivo en el hígado debido a un importante desequilibrio entre la producción y la degradación de matriz extracelular. Mientras que la fibrosis hepática es un proceso reversible, su estadío final, la cirrosis, está considerado como el estadío irreversible y final de la enfermedad. Cuando la cirrosis es ya severa se produce la completa desestructuración del parénquima hepático dando lugar a la aparición de insuficiencia hepática y trastornos hemodinámicos graves. Una de las primeras complicaciones hemodinámicas es la aparición de hipertensión portal que tiene lugar como consecuencia de un incremento de la resistencia intrahepática al paso de flujo sanguíneo portal así como de un aumento intrínseco del tono vascular de la microvasculatura hepática. Existe un enorme interés científico no sólo por esclarecer los mecanismos celulares implicados en el desarrollo de fibrosis y cirrosis hepática sino también por identificar nuevas estrategias terapéuticas enfocadas a revertir o prevenir la progresión de esta enfermedad hepática. Una de las posibles dianas terapéuticas la constituye la vía biosintética de la 5-LO. La 5-LO es la enzima clave responsable de la síntesis de LTs, importantes mediadores lipídicos derivados del AA. Este grupo de eicosanoides incluye al LTB4 implicado principalmente en la respuesta inflamatoria y los cisteinil-LTs (LTC4/LTD4/LTE4) que son potentes agentes vasoconstrictores capaces de incrementar la permeabilidad vascular y ejercer importantes funciones proliferativas y profibrogénicas. En el hígado y a nivel experimental, los cisteinil-LTs son capaces de modificar tanto la presión hepática de perfusión como la extravasación de fluido vascular. Además, los estudios clínicos demuestran que en los pacientes con hepatopatía existe un incremento en la producción de estos eicosanoides lo que se ha asociado con el desarrollo de un incremento en la resistencia intrahepática y la aparición de colestasis. Sin embargo y hasta la realización de este proyecto de tesis doctoral, no se conocían con exactitud los mecanismos celulares de síntesis de estos eicosanoides en el hígado así como la implicación fisiopatológica de estos compuestos en el desarrollo de la cirrosis hepática y sus complicaciones. Por todo ello, los objetivos generales de este trabajo fueron: 1. Caracterizar la biosíntesis y papel funcional de los cisteinil-LTs en el sinusoide hepático. 2. Investigar el papel de la célula de Kupffer y de la 5-LO en la patogénesis de la fibrosis hepática experimental. En resumen, los resultados de este trabajo indicaron que en el hígado, no sólo la célula de Kupffer contribuye a la producción endógena de cisteinil-LTs sino que los hepatocitos contribuyen de forma importante a su producción mediante metabolismo transcelular. Además, estos eicosanoides pueden ejercer acciones paracrinas sobre las células hepáticas estrelladas y contribuir así al aumento de la resistencias intrahepáticas y a la aparición de hipertensión portal. Además, los resultados proporcionan la primera evidencia de que la presencia activa de la vía metabólica de la 5-LO es crítica para la supervivencia de las células de Kupffer y demuestran que la inhibición de la vía de la 5-LO en las células de Kupffer puede reducir la progresión de la fibrosis durante el daño hepático crónico experimental.
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    Localización subcelular y regulación post-traduccional del transportador hepático de adenosina Rcnt2
    (Universitat de Barcelona, 2004-09-28) Duflot, Sylvie; Pastor Anglada, Marçal; Casado, Javier (Casado Merediz); Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] Las funciones del hígado son importantes debido a su localización estratégica, entre el sistema digestivo y el resto del cuerpo (la circulación sistémica). La generación de los anticuerpos contra los transportadores de nucleósidos sodio-dependientes rCNT1 (pirimidina preferente) y rCNT2 (purina preferente) permitieron identificar la presencia de estos dos transportadores en hígado. El primer objetivo de esta tesis es establecer la localización y la distribución subcelular de rCNT1 y rCNT2 en hepatocitos de rata. Los hepatocitos representan un 60-80% de la masa celular total del hígado; son células altamente polarizadas y se caracterizan por tener una membrana plasmática diferenciada en tres dominios funcionales diferentes: la membrana basal la apical y la lateral. Por estas características y por ser muy activos metabolitamente, las células hepáticas son un buen modelo para el estudio de las rutas endocíticas. Examinamos la localización subcelular de tres maneras distintas. Primero, detectamos por técnicas de transporte y por Western blot la expresión de CNT1 y CNT2 en fracciones enriquecidas en membranas plasmáticas canaliculares y basolaterales. Segundo, determinamos la cantidad proteica y la distribución de CNT1 y CNT2 en fracciones purificadas de endosomas de hígado de rata, mediante utilización de anticuerpos contra estos transportadores. Tercio, por técnicas de microscopía electrónica. Estos estudios indican que el transportador de nucleosidos CNT1 llega en la membrana canalicular, en la cual el transportador es biológicamente activo, por una ruta indirecta a través de la membrana basolateral. Su inserción se realiza cerca de microdominios especializados enriquecidos en caveolas. CNT2 se detecta de manera casi exclusiva en preparaciones enriquecidas en membranas plasmáticas basolaterales en las cuales el transportador es activo. Estos estudios nos indican que los dos transportadores CNT1 y CNT2 tienen una ubicación diferente en células hepáticas, por lo que estos dos transportadores parecen estar diferencialmente regulados. En la segunda parte de esta tesis examinamos las interacciones entre el transportador concentrativo de adenosina CNT2 y los receptores purinérgicos. Las células hepáticas previamente tratadas, a corto plazo, con el agonista del receptor A1, (-)-N(6)-(2-phenylisopropyl)adenosine (RPIA) produce el incremento de la actividad de transporte de CNT2. Este efecto se inhibe en presencia de inhibidores de los canales KATP y se mimetiza en presencia de activadores de dichos canales. Estos estudios revelan que en células hepáticas, la actividad de transporte de CNT2 se regula por activación de los receptores A1, vía los canales KATP. Se ha demostrado también que la inducción de la actividad de transporte de CNT2 mediante la apertura de los canales KATP es dependiente de la activación de la PKC. Por ultimo, observamos que la glicemia y el metabolismo de la glucosa podrían afectar la regulación purinérgica de CNT2 ya que la inducción de la actividad de CNT2 mediante el receptor A1 puede ser modulada con la concentración en glucosa del medio. Estudiamos en la tercera parte de esta tesis el papel del óxido nítrico y de la PKC en la activación post-traduccional de CNT2 en células hepáticas. Medimos la actividad de transporte de CNT2 en células Fao y en cultivo primario de hepatocitos después de incubar las células con diferentes activadores e inhibidores de la óxido nítrico sintasa (NOS). El resultado fue que la inhibición de la NOS provoca un aumento de la actividad de transporte de CNT2 de un 60%. Mediante inhibidores de la actividad de la PKC y bloqueadores de los canales KATP, determinamos que la disminución de la concentración intracelular de óxido nítrico contribuye en la activación, a corto plazo, del transportador CNT2 mediante la activación, independientemente de la PKC, de los canales KATP.
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    Regulación transcripcional del gen de Mitofusina 2 en músculo esquelético
    (Universitat de Barcelona, 2004-12-21) Soriano Zaragoza, Francesc X. (Francesc Xavier); Zorzano Olarte, Antonio; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] Mitofusina 2 (Mfn2) es una proteína de fusión mitocondrial. Las evidencias experimentales demuestran una menor expresión génica de Mfn2 en músculo esquelético de sujetos obesos y pacientes diabéticos de tipo 2. Al inhibir la expresión de Mfn2 en células en cultivo se reduce el consumo de oxígeno, el potencial de membrana mitocondrial y la oxidación de glucosa, indicando un papel relevante de Mfn2 en la biología mitocondrial así como en la fisiopatología de la obesidad y/o la diabetes de tipo 2. Además, se han relacionado mutaciones en el gen de Mfn2 con la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth de tipo 2 y se le ha descrito un papel antiproliferativo en desordenes vasculares. Consecuentemente, el estudio de la regulación de la expresión génica de Mfn2 es de notable interés. En esta tesis, se ha clonado el promotor humano de Mfn2 y se ha determinado que carece de caja TATA y se localiza en una isla CpG, lo que lo hace susceptible de ser regulado por metilación. En músculo esquelético posee al menos 6 inicios de transcripción en una ventana de 171 pares de bases. Estudios con genes reporteros han determinado que Sp1 podría tener un papel relevante dirigiendo a la maquinaria basal de transcripción para formar el complejo de preiniciación. La expresión de Mfn2 es mayor en tejidos con requerimientos energéticos elevados. Ensayos con genes reporteros han permitido identificar factores de transcripción que podrían ser responsables de la expresión dependiente de tejido. Se ha estudiado con detalle la inducción de Mfn2 en músculo esquelético y tejido adiposo marrón con la exposición al frío y tratamiento con agonistas de los receptores beta-3-adrenérgicos, condiciones ambas caracterizadas por un elevado gasto energético. El aumento de expresión de Mfn2 en estas condiciones es mediado por PGC-1-alfael cual coactiva a ERR-alfa que se une al promotor de Mfn2 en forma de monómero entre las bases -413 y -408. El incremento del potencial de membrana mitocondrial asociado a la expresión de PGC-1-alfa es inhibido por la represión de la expresión de Mfn2 . Mfn2 podría ser un efector crucial en la activación mitocondrial inducida por PGC-1-alfa. Se han aportado nuevas evidencias de la relevancia de Mfn2 en el control de la oxidación mitocondrial de substratos al mostrar una mayor expresión de Mfn2 en fibras musculares oxidativas que en fibras glucolíticas. La transcripción de Mfn2 aumenta en respuesta a incrementos en la concentración de calcio intracelular. Nuestros resultados sugieren que MEF2, el cual se une y activa al promotor de Mfn2 , podría ser un efector de la cascada de señalización iniciada por el calcio citosólico. Los datos obtenidos indican que la expresión de Mfn2 en músculo esquelético se incrementan en condiciones de elevado gasto energético lo cual estimula la oxidación de substratos y provoca incrementos en el potencial de membrana mitocondrial. Dependiendo de la demanda celular de ATP, el potencial de membrana mitocondrial se disipa para producir ATP o generar calor. ENGLISH
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    Transportador de aminoácidos heteromérico xCT: identificación, caracterización funcional y topología
    (Universitat de Barcelona, 2004-10-21) Gasol Escuer, Emma; Palacín Prieto, Manuel; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] La familia de transportadores heteroméricos de aminoácidos posee la característica única de estar compuestos por dos subunidades: una subunidad pesada y una subunidad ligera unidas por un puente disulfuro. Mutaciones en alguno de sus miembros son responsables de aminoacidurias hereditarias, como la lisinuria con intolerancia a proteínas (LPI) o la cistinuria. Al inicio de esta tesis, nos propusimos identificar alguna nueva subunidad ligera humana de esta familia. Mediante búsqueda por homología de secuencia se clonó el cDNA correspondiente a una nueva proteína altamente homóloga a una proteína de ratón asociada al sistema de transporte xc-. La caracterización funcional confirmó que xCT humano, en combinación con 4F2hc, induce una actividad de transporte de cistina y glutamato, con sodio-independencia (sistema xc-). Los perfiles de captación de los sustratos en función del pH del medio de transporte indican que tanto el L-glutamato como la L-cistina son transportados de forma aniónica, cada uno con una carga negativa neta. Por experimentos de salida de sustrato se determinó el carácter intercambiador de este transportador, con una estequiometría de 1:1. El patrón de expresión de xCT humano por Northern blot muestra una ligera banda presente únicamente en cerebro. Experimentos de RT-PCR también resultaron positivos para los islotes pancreáticos y líneas celulares correspondientes a líneas epiteliales y tumorales, mientras riñón e hígado no mostraron ninguna señal. El papel fisiológico de xCT parece estar implicado en la captación de cistina para la síntesis de glutatión y su mantenimiento, dándole un papel relevante en situaciones de estrés oxidativo. A continuación se abordó la determinación de la topología de xCT como modelo de subunidad ligera. Experimentos de inmunodetección evidencian la localización intracelular de los dos extremos de la proteína. Utilizando la estrategia de introducir cisteínas individuales en los distintos loops y testar su accesibilidad a reactivos tiol-específicos, la topología de xCT es compatible con un modelo de 12 dominios transmembrana. Los resultados obtenidos en la zona IL2-3, con dos residuos de accesibilidad exterior (el 110 y 112) flanqueados por residuos de accesibilidad interior (el 102, 109 y 116) en un rango de 15 aminoácidos nos hacen pensar en una estructura de reentrant loop, con el residuo H110 como ápice. El hecho que estas estructuras suelen ser zonas asociadas a la ruta de paso del sustrato del transportador, nos llevó a estudiar la implicación del residuo H110. En resumen, los resultados muestran que i) la biotinilación del residuo H110C se bloquea por los sustratos y el inhibidor no transportable 4SCPG; ii) la inactivación provocada por MTSES en el transporte de h110c también es protegida por los sustratos con una IC50 similar a la Km para cada sustrato; iii) esta protección es independiente de temperatura, y por tanto no implica grandes cambios conformacionales; y iv) aunque los mutantes H110C y H110D no alteraron la Km del transportador ni su especificidad de sustrato, la sustitución por una lisina inactiva totalmente la función de xCT. Por tanto, tenemos evidencias de que H110 se encuentra cercano al lugar de unión al sustrato o ruta de paso del mismo. Estos resultados pueden encontrarse en las publicaciones siguientes: J Biol Chem (2004) vol. 279, 31228-36, J Biol Chem (2004) vol. 279, 11214-21, y Pflugers Arch . (2001) vol. 442 (2) 286-296. ENGLISH
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    Mecanismes associats al desenvolupament de la caquèxia en estats patològics
    (Universitat de Barcelona, 2005-01-14) Figueras Polo, Maria Teresa; Argilés Huguet, Josep Ma.; Carbó Carbó, Neus; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [cat] Durant certes situacions catabòliques, com el càncer o la sèpsia entre d'altres, es dóna un fet comú que és la pèrdua de massa muscular. En el nostre grup d'investigació s'ha estudiat en profunditat el desgast muscular associat a la síndrome de la caquèxia. Així, s'ha identificat el sistema proteolític dependent d'ATP i ubiquitina com a mecanisme que participa en l'activació de la proteòlisi muscular. A més, s'han identificat determinades citocines, particularment el TNF-alfa, elements promotors del desenvolupament de la síndrome de la caquèxia cancerosa. L'objectiu d'aquesta tesi doctoral ha estat aprofundir en el coneixement dels mecanismes responsables de la pèrdua de massa muscular en diversos estats patològics. En concret, el paper del TNF-alfa en la caquèxia cancerosa, sèpsia i MPOC (malaltia pulmonar obstructiva crònica) i el possible potencial terapèutic de la citocina anabòlica IL-15. Les aproximacions experimentals utilitzades han estat les següents: d'una banda, per l'estudi de la caquèxia cancerosa, vàrem utilitzar el model tumoral de l'hepatoma ascític Yoshida AH-130 en rata, i biòpsies musculars de pacients amb càncer de pàncrees. Per altra banda, també s'han utilitzat biòpsies musculars de malalts MPOC. Així mateix, es va emprar un model de sèpsia en rata. D'aquest estudi es va concloure: 1. En la síndrome de la caquexia s'observa una pèrdua de proteïna muscular alhora que un procés apoptòtic actiu mesurat com a fragmentació del DNA. Aquest darrer fet ha estat demostrat en dues situacions patològiques on es dóna aquesta síndrome: càncer (model de l'hepatoma Yoshida AH-130 i càncer de pàncrees humà) i sèpsia. 2. El TNF-alfa està implicat en la inducció de l'apoptosi en múscul esquelètic donat que el tractament amb rolipram reverteix parcialment la fragmentació del DNA observada en rates sèptiques. 3. L'augment de l'expressió muscular dels receptors de TNF-alfa així com l'increment de la relació Bax/Bcl-2 (detectat en càncer experimental) serien mecanismes implicats en la inducció de l'apoptosi i indicarien una major sensibilitat del múscul esquelètic a les accions catabòliques del TNF-alfa. 4. En el model experimental de caquèxia cancerosa s'observa un increment de la carbonilació de proteïna muscular, alhora que un augment en el contingut de iNOS i de les UCPs. Aquests fets posen de manifest que el múscul esquelètic pateix estrés oxidatiu durant el procés de caquèxia. 5. Els malalts MPOC presenten uns nivells musculars de glutatió reduït (GSH) inferiors als individus sans, fet que és més acusat a mesura que disminueix l'índex de massa corporal. En aquests malalts s'observa un augment de l'expressió muscular de la gamma-GCS que podria actuar com a mecanisme compensatori dels baixos nivells de GSH. L'estrés oxidatiu muscular detectat en malalts MPOC podria ser el responsable de l'augment de l'expressió gènica de TNF-alfa observada a múscul esquelètic. 6. En individus sans, el programa d'entrenament millora el seu estat rèdox muscular mentre que en malalts MPOC no es millora sino que l'estrés oxidatiu muscular és més acusat. 7. La IL-15 es comporta clarament com una citocina anabòlica a nivell de múscul esquelètic exercint les següents accions: reverteix la degradació proteica i bloqueja l'apoptosi. 8. Els mecanismes associats a les accions terapèutiques de la IL-15 es podrien explicar a nivell de la normalització de l'expressió dels receptors de TNF-alfa i a la inhibició de l'activació del sistema proteolític dependent d'ATP i ubiquitina a múscul esquelètic alhora que disminueix la proteïna iNOS i augmenta l'expressió de UCP2 i UCP3 contrarrestant l'estrés oxidatiu en aquest teixit.
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    Estudio de la vía de presentación de péptidos por moléculas de MHC de clase II mediante estrategias proteómicas
    (Universitat de Barcelona, 2005-02-25) Carrascal Pérez, Montserrat; Abián, Joaquín; Jaraquemada, Dolores; Llobera i Sande, Miquel; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] En situaciones patológicas, como en el caso de la autoinmunidad, las células epiteliales de tejidos expresan ectopicamente moléculas de MHC de clase II. El estudio de los mecanismos que dan lugar a la formación de los complejos MHC-péptido, su presentación en la superficie de la APC y el reconocimiento de los mismos por parte de las células T es fundamental para poder entender, no sólo la respuesta inmune a infecciones, sino también patologías tan relevantes como el cáncer, la autoinmunidad o el rechazo de y/o mantenimiento de la enfermedad. En esta tesis se ha abordado el estudio de la presentación de péptidos por moléculas de MHC de clase II utilizando diversas estrategias proteómicas. En primer lugar, el trabajo se centró en la caracterización de los repertorios peptídicos asociados a una APC y a células epiteliales que expresaban moléculas de MHC de clase II, secuenciándose más de 300 ligandos peptídicos, incluyendo diversos péptidos presentados ex vivo en tiroides afectados por una patología autoinmune. Mediente este estudio se mostró que existen diferencias en los repertorios asociados a las células epiteliales frente a los presentados por las APC, tanto en las características de los péptidos como en las de las proteínas de las cuales derivan. Asimismo, se muestra como la expresión de las chaperonas HLA-DM y Ii afecta a las características del repertorio. Finalmente, se identificaron péptidos de clase II presentados en tiroides humanos afectados por la enfermedad de Graves-Basedow, entrre ellos un péptido derivado de la tiroglobulina, una proteína descrita como autoantígeno de esta enfermedad. En una segunda parte del trabajo se ha estudiado el efecto de la transfección de las moléculas HLA-DR, HLA-DM y Ii sobre el proteoma de las células epiteliales y se han identificado diversas proteínas implicadas en este proceso, mostrando que a pesar de no existir cambios drásticos en el proteoma global, algunas proteínas implicadas en el metabolismo celular varían su expresión. Asimismo, se han identificado 30 proteínas que se encuentran asociadas directamente o a través de otras moléculas con las moléculas de HLA-DR4 en la célula , entre ellas diversas chaperonas y enzimas de oxidoreducción, y proteínas implicadas en el transporte asociado a membranas. La expresión de estas proteínas dependía además de la expresión de la chaperonas Ii y DM por lo que se sugiere que algunas podrían estar implicadas en la generación, procesamiento o presentación de péptidos por las moléculas de MHC de clase II.
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    Análisis del DNA mitocondrial y de la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial en la enfermedad de Alzheimer de tipo esporádico
    (Universitat de Barcelona, 2004-12-16) Rodríguez Santiago, Benjamín; Nunes Martínez, Virginia; Palacín Prieto, Manuel; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] Numerosos estudios han relacionado la enfermedad de Alzheimer (EA) con defectos mitocondriales. Tales defectos incluyen anomalías de tipo estructural, bioquímico y genético. Entre las de tipo genético destacan los reordenamientos y las mutaciones puntuales descritas en el DNA mitocondrial (mtDNA). Otros estudios no han podido confirmar esos hallazgos. Objetivo: Estudiar la incidencia de defectos en el mtDNA (mutaciones puntuales, reordenamientos, depleción, reducción en la expresión de genes mitocondriales) de pacientes con EA y la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial y determinar las posibles diferencias respecto a individuos control. Pacientes y métodos. Necropsias de cerebelo, córtex frontal e hipocampo de pacientes con EA y controles. También se dispuso de sangre de enfermos vivos diagnosticados de EA y de controles. Resultados: No se observaron diferencias entre pacientes y controles, ni en tejidos cerebrales ni en sangre en los análisis realizados mediante Southern. No se halló asociación entre las mutaciones puntuales analizadas, reordenamientos, depleción o reducción en la expresión de genes mitocondriales y la EA. Pacientes y controles mostraros similares tasas de respiración y actividades enzimáticas de los complejos respiratorios, tampoco hubo diferencias significativas al estudiar la peroxidación (indicador del estrés oxidativo) en pacientes y controles. Conclusiones. Los resultados obtenidos no apoyan la hipótesis de una implicación mitocondrial en la EA en los pacientes analizados, lo cual no descarta la posible existencia de otras mutaciones puntuales en otras regiones no analizadas y/o eventualmente de otros defectos mitocondriales no analizados en esta tesis que contribuyan al desarrollo de la EA.
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    Clonaje y caracterización de una nueva forma soluble de TNFR2 producida por splicing alternativo. Estudio de su implicación en patologías asociadas a inflamación.
    (Universitat de Barcelona, 2005-01-26) Láinez Mas, Begoña; Fernández-Real Lemos, José Manuel; López-Soriano, Francisco J.; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [cat] El factor de la necrosis tumoral, TNF-alfa, es una citocina pleiotrópica implicada en un amplio espectro de respuestas inflamatorias y del sistema inmune. El efecto biológico del TNF-alfaestá mediado por dos receptores de membrana, el receptor 1 de TNF, TNFR1 y el receptor 2 de TNF, TNFR2. Estos dos receptores se pueden presentar como receptores solubles formados a partir del procesamiento proteolítico de la región extracelular del receptor de membrana. Se han descrito concentraciones elevadas de receptor soluble de TNFR2 en el suero de múltiples patologías inflamatorias. En este trabajo, describimos por primera vez una isoforma de RNAm de TNFR2 humano, producida por splicing alternativo, a la que le faltan los exones 7 y 8 que codifican la mayor parte de la región citoplasmática y parte del domininio intracitoplasmático de la proteina. El splicing alternativo de los dos exones produjo un cambio en la pauta de lectura, lo que llevó a la aparición de un nuevo codón de parada tras 6 nuevos aminoácidos. Se obtenía de este modo, un cDNA que codificaba una proteína de TNFR2 formada por la misma región extracelular y los mismos 5 primeros aminoácidos del dominio transmembrana, que el TNFR2 nativo, seguidos de 6 nuevos aminoácidos como único extremo carboxilo terminal. El estudio de la expresión de la proteína en células tranfectadas con el cDNA de esta isoforma, mostró la naturaleza soluble de esta proteína. La proteína poseía un peso molecular de aproximadamente 42 KDa. En un ensayo de citotoxicidad inducida por TNF-alfa, se mostró que esta isoforma podía bloquear la apoptosis inducida por TNF-alfa lo que sugiere su función reguladora de la acción del TNF como antagonista de su función biológica. Se desarrolló un ELISA que cuantifica el receptor soluble generado por splicing alternativo. Y se determinaron las concentraciones de receptor soluble producido por splicing alternativo en el suero de individuos sanos y en pacientes de diferentes patologías inflamatorias. Nuestros datos muestran que el receptor soluble producido por splicing alternativo está presente en el suero de individuos sanos a bajas concentraciones y a concentraciones elevadas en sujetos con sepsis y artritis reumatoide. Se determinó que existe una asociación negativa entre el receptor soluble producido por splicing alternativo y varios componentes del síndrome metabólico y también con la resistencia a la insulina. Por otro lado, se observó que los pacientes de artritis reumatoide con valores muy elevados de isoforma, presentaban, probablemente una mejor respuesta a la terapia con anticuerpos anti-TNF-alfa.
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    Diferenciación adipocitaria y factores reguladores de la biogénesis mitocondrial. Efectos de los fármacos antiretrovirales.
    (Universitat de Barcelona, 2004-12-20) Rodríguez de la Concepción, María Luisa; Villarroya i Gombau, Francesc; Giralt i Oms, Marta; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] Los resultados presentados en esta Tesis se engloban en tres bloques de estudio: La implicación del adipocito marrón en la lipomatosis inducida por la terapia antiretroviral de elevada actividad (HAART), el estudio de nuevos factores reguladores de la función mitocondrial en el adipocito marrón y el efecto de los fármacos antiretrovirales en adipocitos en cultivo. El análisis de la expresión del gen marcador del adipocito marrón UCP-1 en varios lipomas de pacientes infectados con VIH y en terapia antiretroviral implica al adipocito marrón en la etiopatología de la lipomatosis asociada a la terapia HAART. El estudio de la regulación de la biogénesis mitocondrial a nivel molecular en adipocitos marrones, nos llevó a observar que la diferenciación del adipocito marrón va asociada a la inducción de los factores de transcripción mitocondrial B1 y B2 y el co-activador PGC-1-alfa, en asociación con una incrementada biogénesis mitocondrial. La expresión génica de estos factores es regulada de forma positiva por agonistas de PPAR-gamma e insulina. Por el contrario, la noradrenalina reprime la expresión de los factores de transcripción mitocondrial B1 y B2 por mecanismos dependientes de transcripción e independientes de síntesis proteica. Ello da lugar a una reducción en la expresión de genes codificados por el genoma mitocondrial como la subunidad II de la citocromo c oxidasa. Este efecto es dependiente del grado de diferenciación del adipocito marrón y se ve favorecido por la presencia de activadores de PPAR-gamma o insulina. La expresión del co-activador PGC-1-alfa se induce por noradrenalina, agonistas PPAR-gamma y agonistas RXR en adipocitos marrones diferenciados, pero no en preadipocitos. Dichas inducciones se dan por mecanismos independientes de síntesis proteica. La inducción de PGC-1-alfa por la noradrenalina se ve favorecida por la presencia de activadores PPAR-gamma. La inducción por agonistas PPAR-gamma y RXR se bloquea por un antagonista PPAR-gamma y es independiente de la activación de receptores adrenérgicos. Se describe, por tanto, una nueva vía de regulación PPAR-gamma/RXR-dependiente del gen PGC-1-alfa. Se estudió el efecto del litio, un fármaco utilizado en el tratamiento de la esquizofrenia y el trastorno bipolar, sobre la diferenciación del adipocito marrón. Se observó que el litio inhibe de forma dependiente del tiempo de exposición y de la dosis la diferenciación morfológica de adipocitos marrones en cultivo, así como la expresión de genes de expresión preferencial en al adipocito marrón. Estudiamos el efecto de los fármacos antiretrovirales inhibidores de la transcriptasa reversa sobre el adipocito marrón mediante el análisis de su diferenciación y expresión génica en relación con la función mitocondrial. Los resultados nos indicaron que los inhibidores de la transcriptasa reversa no-análogos de nucleósido tienen un efecto opuesto sobre la diferenciación del adipocito marrón: el efavirenz bloquea la acumulación de lípidos mientras que la nevirapina tiene un efecto positivo global sobre la diferenciación adipocitaria, biogénesis mitocondrial y expresión de UCP-1. Los inhibidores de la transcriptasa reversa análogos de nucleósidos no afectan la diferenciación del adipocito marrón. La estavudina, zidovudina y didanosina provocan una disminución en el contenido de mtDNA, aunque la expresión del genoma mitocondrial sólo se encuentra disminuida en las células tratadas con didanosina. La compensación a la depleción del mtDNA en las células con estavudina podría explicarse por el aumento en la expresión de los factores de transcripción mitocondrial. Además, la estavudina induce de manera específica la expresión génica de UCP-1 mediante mecanismos que implican la vía del ácido retinoico. Por último, desarrollamos un modelo celular de adipocitos humanos en cultivo primario y lo utilizamos en el análisis del efecto del fármaco antiretroviral didanosina. Los resultados nos mostraron que preadipocitos humanos en cultivo primario pueden diferenciarse a adipocitos con características morfológicas, de expresión génica y funcionales propias del adipocito blanco humano. La didanosina ejerce efectos compatibles con un bloqueo en la función mitocondrial.
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    Estudi de la regulació transcripcional del gen de la proteïna desacobladora UCP3
    (Universitat de Barcelona, 2004-11-05) Pedraza González, Neus; Villarroya i Gombau, Francesc; Solanas Garcia, Gemma; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [cat] El gen UCP3 s'expressa majoritàriament al múscul esquelètic i al TAM en rosegadors, i pràcticament de manera exclusiva al múscul esquelètic en humans. El gen s'activa en resposta a diferents estímuls, entre els quals trobem l'àcid retinoic, els àcids grassos no esterificats i les hormones tiroïdals. L'estudi de la regulació de la transcripció del gen UCP3 en cèl·lules musculars ens ha permès obtenir informació sobre els mecanismes moleculars responsables de l'expressió d' UCP3 al múscul esquelètic i de la modulació d'aquesta expressió deguda als estímuls esmentats. L'estudi de la regulació de l'expressió d' UCP3in vivo ens ha permès establir la importància d'alguns d'aquests mecanismes en un context fisiològic. D'acord amb l'expressió específica d' UCP3 al múscul, el factor de transcripció miogènic MyoD és necessari per l'activitat basal del promotor del gen UCP3 . MyoD regula l'expressió del gen humà UCP3 a través d'unes seqüències semblants a Ebox properes al lloc d'inici de la transcripció (-29/-9). A més a més, l'activació del promotor del gen humà UCP3 per MyoD és necessària per tal que l'àcid retinoic, els àcids grassos o les hormones tiroïdals en modulin l'activitat. L'àcid retinoic, un conegut activador transcripcional de l'expressió dels gens UCP1 i UCP2 , activa l'expressió del gen UCP3 en cèl·lules musculars diferenciades. La resposta del gen UCP3 humà a l'àcid retinoic està mitjançada pels receptors d'àcid retinoic (RAR-RXR) i l'element de resposta a hormones DR1 (AGGTTTCAGGTCA) situat a la regió proximal (-71/-59) del promotor d' UCP3 . Per altra banda, l'activació del gen UCP3 pels àcids grassos es dóna a través de PPARalfa o PPARdelta (receptors activats per proliferadors peroxisomals) i de l'element DR1, in vitro i in vivo. En ratolins PPAR-alfa-KO s'ha observat una necessitat diferencial de PPAR-alfa per regular l'expressió del gen UCP3 , en funció del teixit (cor o múscul esquelètic) i de l'estadi del desenvolupament (nounats i adults). A nivell molecular, els processos d'acetilació són importants per l'activació del promotor del gen UCP3 . El coactivador p300 és capaç de coactivar la resposta dependent de lligand de PPAR-alfa en el promotor, i l'activitat acetiltransferasa de p300 és necessària per aquesta coactivació. Tant l'estat d'acetilació de les histones com de MyoD són importants per l'activació del promotor del gen UCP3 . Finalment, s'ha observat que les hormones tiroïdals activen l'expressió del gen UCP3 humà i de ratolí al múscul esquelètic in vivo i en cèl·lules musculars en cultiu. Les hormones tiroïdals activen el promotor d' UCP3 a través dels receptors d'hormones tiroïdals (TR) i la regió del DNA que conté l'element DR1. Per tant, l'element DR1 present en la regió proximal del promotor del gen UCP3 és un element multihormonal que mitjança l'activació del gen UCP3 per l'àcid retinoic, les hormones tiroïdals i els àcids grassos. En el futur, seria interessant estudiar la relació que s'estableix entre aquestes vies de senyalització in vivo .
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    Implicació dels proteoglicans i del receptor lipoproteic LRP en l'acumulació lipídica en la paret vascular
    (Universitat de Barcelona, 2004-04-13) Otero Viñas, Marta; Badimón, Lina, 1953-; Llorente Cortés, Vicenta; Ramírez i Sunyer, Josep Ignasi; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [cat] L'objectiu del present treball de tesi fou estudiar la implicació dels principals proteoglicans presents en la paret vascular i del receptor lipoproteic LRP ("Low density lipoprotein receptor-related protein") en la transformació de les cèl·lules musculars llises de l'íntima arterial en cèl·lules escumoses, elements clau en la iniciació i progressió de la lesió ateroscleròtica. A fi de desenvolupar aquest objectiu s'analitzà la capacitat del proteoglicà versicà de modificar les lipoproteïnes de baixa densitat (LDL) infiltrades en la paret vascular i s'analitzà com aquestes partícules de LDL modificades eren internalitzades pel receptor lipoproteic LRP en les cèl·lules musculars llises vasculars. També s'estudià la contribució dels proteoglicans heparan sulfat com a mecanismes independents o de cooperació amb el receptor LRP en la internalització de les LDL modificades en les cèl·lules musculars llises vasculars. D'altra banda, s'estudiaren els nivells d'expressió del receptor LRP durant el desenvolupament de la lesió ateroscleròtica i com l'acumulació lipídica intracel·lular regula l'expressió d'aquest receptor en les cèl·lules musculars llises vasculars humanes.
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    Determinació d'estructura cristal·lina d'alcohol deshidrogenases dependents d'NADP(H)
    (Universitat de Barcelona, 2004-05-28) Valencia Sanmiguel, Eva María; Fita Rodríguez, Ignasi; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [cat] Amb la realització d'aquesta tesi doctoral es volia aprofundir en el coneixement de les ADHs que pertanyen a la superfamília de les MDR, contenen zinc i són dependents de NADP(H). Les alcohol deshidrogenases (ADHs) són enzims que catalitzen l'oxidació reversible d'alcohols als corresponents aldehids o cetones, amb la conseqüent reducció de NAD o NADP. La majoria d'ADHs de llevat i vertebrats pertanyen a la superfamília de les deshidrogenases/reductases de cadena mitjana (MDR), concretament en vertebrats, tots els membres de la família ADH són metaloenzims, que contenen zinc i són MDRs. Així doncs, els objectius de la tesi s'han centrat en: 1. La cristal·lització i determinació de l'estructura d'ADH8 de R. Perezi . Conèixer l'estructura de l'ADH8 ens aporta les bases de l'especificitat de cofactor d'aquest enzim, única a vertebrats, i també serveix per explicar la seva peculiarment elevada activitat envers retinal. 2. La cristal·lització i resolució de l'estructura de ScADH6p. L'estructura cristal·lina de la CAD depenent de NADP(H) de S. Cerevisiae (ScAdh6p) ha estat la primera estructura tridimensional determinada per un enzim CAD així com per un membre de la superfamília de les MDRs a S. Cerevisiae . Ens proporciona un patró estructural per entendre el funcionament de la ScAdh6p que potser es podrà utilitzar com a referència per les proteïnes CAD en general. A més ha aportat informació addicional sobre l'especificitat envers el cofactor NADP(H).
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    Anàlisi de l'expressió de NOR-1 en les cèl·lules musculars llises i de la seva implicació en la proliferació cel·lular
    (Universitat de Barcelona, 2004-03-25) Rius Capalvo, Jordi; Badimón, Lina, 1953-; Martínez González, José; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [cat] Dado que las células musculares lisas vasculares (CMLV) juegan un papel clave en el desarrollo de la aterosclerosis, conocer los genes que regulan la proliferación y migración de estas células pude conducir a encontrar nuevas dianas farmacológicas para tratar esta patología. Nosotros descubrimos que el receptor nuclear huérfano NOR-1/NR4A3 se encuentra expresado en CMLV estimuladas con suero y distintos mitógenos. Entre los componentes del suero cabe destacar como principal inductor de NOR-1 las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y en menor medida las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Por otra parte, distintos factores de crecimiento en especial la trombina y el PDGF, ambos generados en eventos trombóticos, también inducen la expresión de este origen. Los mecanismos moleculares que regulan este proceso son complejos; participan proteínas G sensibles a la toxina pertusis, incrementos en la concentración citosólica de calcio y activación de distintas proteínas quinasas como la PKC, la PKA y MAPKs como la ERK y la p38 MAPK. Estas quinasas pueden activar directa o indirectamente (dependiendo del tipo y contexto celular), al factor de transcripción CREB. Nosotros observamos por primera vez que las LDL son capaces de inducir la activación de CREB y que este mecanismo es dependiente tanto del calcio como de la PKC. CREB se une al promotor de NOR-1 mediante su interacción con tres cajas CRE; además CREB es esencial en la actividad de este promotor, tal como analizamos mediante la cotransfección de un dominante negativo de CREB así como eliminando las cajas CRE por mutagénesis dirigida. Para evaluar el papel de NOR-1 en la proliferación celular, usamos oligodeoxinucleótidos (ODN) antisentido para inhibir la expresión de este gen. Analizamos de manera independiente dos ODN los cuales disminuyen de forma específica a la expresión de NOR-1. En estas condiciones, estos ODN inhiben la síntesis de DNA inducida tanto por el suero como por las LDL. Además, mediante citometría de flujo in vitro de reparación tisular, el bloqueo de la expresión de NOR-1 produce una inhibición de la capacidad de las células para recuperar el área dañada. De todos estos resultados se pude concluir que NOR-1 regula la proliferación de las CMLV y que por tanto podría ser una nueva diana terapéutica en las patologías en que este involucrada una excesiva proliferación de estas células.
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    Investigación y desarrollo de abaperidona, nuevo antipsicótico 5HT2A/D2 y alfa1-adrenérgico. Modelos "in vitro" e "in vivo" predictivos de eficacia y efectos adversos
    (Universitat de Barcelona, 2004-03-26) Príncep i Mota, Marta; Guglietta, Antonio; Pastor Anglada, Marçal; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
    [spa] La esquizofrenia es una enfermedad altamente prevalente, cerca del 1% de la población, en la que se distinguen tres grandes tipos de sintomatología, los déficits cognitivos, los síntomas positivos y los síntomas negativos, con distinta respuesta a los tratamientos actuales. Abaperidona, es una nueva entidad química investigada y desarrollada como potencial antipsicótico atípico, con un favorable perfil 5HT2/D2 y elevada afinidad por el receptor alfa1-adrenérgico. Abaperidona también mostró afinidad en rango nM por otros receptores centrales (D3, D1, 5HT2C, 5HT1A y H1) y escasa afinidad (superior a 100 nM) por los receptores muscarínicos. Este compuesto se evaluó mediante pruebas predictivas tanto de eficacia antipsicótica como de efectos extrapiramidales (EPS). Abaperidona inhibió de manera dosis dependiente las hiperactividades inducidas por agonistas dopaminérgicos en ratón y revirtió los déficits sensorimotores (PPI) inducidos por apomorfina en ratas. Además, Abaperidona demostró elevada afinidad por el receptor 5HT2A en el córtex y bloqueó potentemente las sacudidas de cabeza inducidas por DOI [1-(2,5-dimetoxi-4-iodofenil)-2-aminopropano, agonista preferente 5HT2A] en ratón, así como tendencia a revertir de manera dosis dependiente la hipolocomoción inducida por mCPP (1-(3-clorofenil)piperazina, agonista 5HT2C). Su potente antagonismo alfa1-adrenérgico se demostró en estudios funcionales en rata anestesiada y desmedulada y en la protección a la letalidad inducida por noradrenalina, a dosis 5 veces inferiores a las necesarias para inducir el bloqueo de los receptores D2. Sin embargo, Abaperidona únicamente indujo EPS a dosis entre 21 (estereotipias inducidas por agonistas dopaminérgicos) y 35 (catalepsia) veces superiores a las dosis predictivas de actividad antipsicótica preclínica, y demostró menor regulación ascendente del receptor D2 en el estriado que Haloperidol y Risperidona tras administración prolongada. Además, la inducción de prolactina debida a la administración del compuesto fue significativamente menor que la inducida por Haloperidol o Risperidona. Abaperidona también demostró una potente acción moduladora del receptor NMDA al inhibir la hiperactividad inducida por dizocilpina (antagonista NMDA) en el mismo rango de dosis que la dosis predictiva de actividad antipsicótica preclínica. Interesantemente, Abaperidona no mostró efectos significativos sobre la presión arterial y escasos efectos sobre frecuencia cardiaca en estudios en ratas conscientes, inclusive a dosis 10 veces superiores a la dosis predictiva de actividad antipsicótica preclínica, a diferencia de Risperidona y Clozapina. Abaperidona también demostró escasa inducción de sedación comparativamente a Haloperidol, Risperidona y Clozapina. En resumen, el antagonismo a los receptores 5HT2A y alfa1-adrenérgico, favorecería las acciones en las vías mesolímbicas y mesocorticales dopaminérgicas frente a las vías dopaminérgicas menores, por lo que podría contribuir a la mejora de la eficacia, incluyendo los síntomas cognitivos y negativos, y minimizando la aparición de EPS, mientras que el antagonismo a 5HT2C, por su acción sobre la vía dopaminérgica tuberoinfundibular, contribuiría a controlar la prolactinemia. Además la modulación de los niveles de glutamato, también contribuiría a la mejora cognitiva y de la sintomatología negativa. En conclusión, Abaperidona mostraría un perfil farmacológico multireceptorial indicativo de actividad terapéutica sobre la sintomatología global de la esquizofrenia, con escasa propensión a la aparición de efectos adversos relacionados con el mecanismo de acción.