Computational Design and Redesign of Hydrolases for Biotechnological Applications

Abstract

[eng] Hydrolases, a versatile class of enzymes, play a pivotal role in numerous biotechnological applications, including waste recycling and improved laundry efficiency in the detergent industry. Recent advances in computational approaches have revolutionized the design and optimization of these enzymes, enabling precise tuning of their activity, and substrate specificity. This thesis highlights the impact of molecular modeling and structure-guided strategies in engineering hydrolases, focusing on both the fine-tuning of natural scaffolds and the creation of de novo catalytic architectures. A metagenomic lipase, LipMRD9, was identified as a dual lipase/PETase and shown to rely on a key residue for productive PET hydrolysis. Guided by physics-based simulations and energy landscape exploration, LipMRD9 was redesigned to yield variants with up to threefold higher PET activity while retaining lipase function. To transcend the limitations of soluble enzymes, pore-forming proteins were engineered into “porezymes” by embedding artificial Ser–His–Asp/Glu catalytic triads within their lumens. These catalytic nanopores displayed hydrolytic activity against PET nanoparticles surpassing benchmark hydrolases under mesophilic conditions, establishing them as a novel class of catalytic pores. Automated computational pipelines extended this principle to large pore scaffolds such as pneumolysin and 𝛼-hemolysin, demonstrating scalability and potential for multisite catalysis. By integrating structural biology, pluriZyme engineering methodologies, and advanced computational design, this work provides complementary solutions for PET degradation and sets the stage for sustainable, cost-effective applications in industrial biotechnology. Future directions emphasize the convergence of computational design with experimental validation to fully unlock the potential of hydrolases in addressing global environmental and industrial challenges.

[cat] Les hidrolases, una classe versàtil d’enzims, tenen un paper fonamental en nombroses aplicacions biotecnològiques, incloent-hi el reciclatge de residus i la millora de l’eficiència del rentat en la indústria de detergents. Els avenços recents en enfocaments computacionals han revolucionat el disseny i l’optimització d’aquests enzims, permetent un ajust precís de la seva activitat i especificitat de substrat. Aquesta tesi ressalta l’impacte de la modelització molecular i de les estratègies guiades per l’estructura en l’enginyeria d’hidrolases, centrant-se tant en el perfeccionament d’andamis naturals com en la creació d’arquitectures catalítiques de novo. Una lipasa metagenòmica, LipMRD9, va ser identificada com un enzim dual lipasa/PETasa i es va demostrar que depèn d’un residu clau per a la hidròlisi productiva del PET. Guiada per simulacions basades en la física i l’exploració del paisatge energètic, LipMRD9 va ser redissenyada per generar variants amb fins a tres vegades més activitat sobre el PET, mantenint la seva funció de lipasa. Per superar les limitacions dels enzims solubles, es van dissenyar proteïnes formadores de porus transformant-les en “porezims” mitjançant la inserció de tríades catalítiques artificials Ser–His–Asp/Glu dins dels seus lúmens. Aquests nanoporus catalítics van mostrar activitat hidrolítica contra nanopartícules de PET que superava les hidrolases de referència en condicions mesofíliques, establint-se com una nova classe de porus catalítics. Els fluxos de treball computacionals automatitzats van estendre aquest principi a grans andamis porosos com la pneumolisina i l’𝛼-hemolisina, demostrant escalabilitat i potencial per a la catàlisi en múltiples llocs. Mitjançant la integració de biologia estructural, metodologies d’enginyeria pluriZyme i disseny computacional avançat, aquest treball ofereix solucions complementàries per a la degradació del PET i estableix les bases per a aplicacions sostenibles i rendibles en biotecnologia industrial. Les direccions futures emfasitzen la convergència del disseny computacional amb la validació experimental per alliberar plenament el potencial de les hidrolases en l’afrontament dels reptes ambientals i industrials a escala global.

[eng] Las hidrolasas, una clase versátil de enzimas, desempeñan un papel fundamental en numerosas aplicaciones biotecnológicas, incluyendo el reciclaje de residuos y la mejora de la eficiencia del lavado en la industria de detergentes. Los avances recientes en enfoques computacionales han revolucionado el diseño y la optimización de estas enzimas, permitiendo un ajuste preciso de su actividad y especificidad de sustrato. Esta tesis resalta el impacto de la modelización molecular y de las estrategias guiadas por la estructura en la ingeniería de hidrolasas, centrándose tanto en el perfeccionamiento de andamios naturales como en la creación de arquitecturas catalíticas de novo. Una lipasa metagenómica, LipMRD9, fue identificada como una enzima dual lipasa/PETasa y se demostró que depende de un residuo clave para la hidrólisis productiva de PET. Guiada por simulaciones basadas en la física y la exploración del paisaje energético, LipMRD9 fue rediseñada para generar variantes con hasta tres veces más actividad sobre PET, manteniendo su función lipasa. Para superar las limitaciones de las enzimas solubles, se diseñaron proteínas formadoras de poros transformándolas en “porozimas” mediante la inserción de tríadas catalíticas artificiales Ser–His–Asp/Glu en sus lúmenes. Estos nanoporos catalíticos mostraron actividad hidrolítica contra nanopartículas de PET que superó a hidrolasas de referencia en condiciones mesofílicas, estableciéndose como una nueva clase de poros catalíticos. Los flujos de trabajo computacionales automatizados extendieron este principio a grandes andamios porosos como la neumolisina y la 𝛼-hemolisina, demostrando escalabilidad y potencial para la catálisis en múltiples sitios. Mediante la integración de biología estructural, metodologías de ingeniería PluriZyme y diseño computacional avanzado, este trabajo ofrece soluciones complementarias para la degradación de PET y sienta las bases para aplicaciones sostenibles y rentables en biotecnología industrial. Las direcciones futuras enfatizan la convergencia del diseño computacional con la validación experimental para liberar plenamente el potencial de las hidrolasas en la resolución de desafíos ambientales e industriales a escala global.