Computational Strategies for Improving PET-Degrading Enzymes: From Atomistic Simulations to AI Stability Prediction

Abstract

[eng] Plastic pollution remains a critical environmental challenge, with polyethylene terephthalate (PET) being one of the most widely used and persistent plastics. Enzymatic PET recycling offers a promising route toward a circular economy, leveraging biocatalysts to depolymerize PET under mild conditions. However, key barriers remain, including enzyme instability at process-relevant temperatures, low depolymerization activity towards post-consumer PET and the resistance of crystalline PET regions to enzymatic attack.

This thesis addresses these challenges through an integrated computational strategy combining atomistic molecular simulations and AI-guided protein stability design.

First, extensive molecular dynamics simulations were employed to investigate PETase-PET interactions at atomic detail. We developed realistic PET oligomer models representing amorphous and crystalline states, capturing experimentally informed torsional preferences. By applying enhanced sampling techniques such as Hamiltonian Replica Exchange and well-tempered metadynamics, we quantified the energetic barriers associated with binding and catalysis on crystalline PET, revealing a ~50 kJ/mol penalty relative to amorphous PET. Additionally, simulations of different PETase variants highlighted the relationship between thermostability, active site integrity, and catalytic competence, offering atomistic explanations for experimental observations.

Second, we developed PANDORA, an AI-based framework for predicting protein stability from sequence alone. Leveraging the Megascale dataset of folding free energies, PANDORA evolved through successive architectures, from one-hot encoded CNNs to graph neural networks and transformer-based embeddings, culminating in a hybrid model that integrates both sequence and structural information. Applied to PETase variants, PANDORA offered accurate ΔG predictions to complement stabilising mutation design.

Together, these complementary approaches deliver mechanistic insights into the molecular determinants of PETase function and provide generalizable computational tools for enzyme engineering. By bridging molecular simulations and AI-based predictions, this work contributes to advancing biocatalytic PET recycling toward industrial feasibility, while also offering frameworks applicable to broader challenges in sustainable materials science and protein engineering.

[cat] La contaminació per plàstics continua sent un repte ambiental crític, amb el polietilè tereftalat (PET) com un dels plàstics més utilitzats i persistents. El reciclatge enzimàtic del PET ofereix una via prometedora cap a una economia circular, aprofitant biocatalitzadors per despolimeritzar el PET en condicions suaus. Tanmateix, persisteixen barreres importants, com la inestabilitat dels enzims a temperatures industrials, la baixa activitat de despolimerització sobre PET post consum i la resistència de les regions cristal·lines del PET a l’atac enzimàtic.

Aquesta tesi aborda aquests reptes mitjançant una estratègia computacional integrada que combina simulacions moleculars atomístiques i disseny de proteïnes basat en IA. Primer, es van emprar simulacions de dinàmica molecular per investigar en detall atòmic les interaccions entre PETasa i PET. Es van desenvolupar models realistes d’oligòmers de PET en estats amorfs i cristal·lins, capturant preferències torsionals derivades de dades experimentals. Mitjançant tècniques de enhanced sampling com Hamiltonian Replica Exchange i well-tempered metadinàmica, es van quantificar les barreres energètiques associades a la unió i la catàlisi sobre PET cristal·lí, revelant una penalització d’uns 20–30 kJ/mol respecte al PET amorf. A més, les simulacions de diferents variants de PETasa van destacar la relació entre termoestabilitat, integritat del (active site) lloc actiu i competència catalítica, oferint explicacions atomístiques per a observacions experimentals.

En segon lloc, es va desenvolupar PANDORA, un marc basat en IA per predir l’estabilitat proteica a partir de la seqüència i l’estructura. Utilitzant el conjunt de dades d'energia lliure (ΔG unfolding) Megascale, PANDORA va evolucionar a través d’arquitectures successives, des de CNN codificats amb one-hot fins a xarxes neuronals de grafs i embeddings de transformador, culminant en un model híbrid que integra informació de seqüència i estructura. Aplicat a variants de PETasa, PANDORA va oferir prediccions precises de ΔG per guiar el disseny de mutacions estabilitzadores.

En conjunt, aquests enfocaments complementaris ofereixen una visió mecanística sobre els determinants moleculars de la funció de la PETasa i proporcionen eines computacionals generalitzables per a l’enginyeria d’enzims. En connectar la simulació molecular amb el disseny basat en IA, aquest treball contribueix a avançar el reciclatge enzimàtic de PET cap a la viabilitat industrial i ofereix marcs aplicables a reptes més amplis en ciència de materials sostenible i enginyeria de proteïnes.