Design and Synthesis of Out-of-Equilibrium Phospholipid Vesicles

Abstract

[eng] This thesis focuses on the design, synthesis and application of out-of-equilibrium (OOE) phospholipids constructed from simple, water-soluble building blocks. Phospholipids are fundamental amphiphiles that spontaneously organize into supramolecular membranes, providing the structural and functional framework of all living cells. Life itself depends on the chemical and physical transformation of diverse biomolecules such as proteins, nucleic acids, carbohydrates, and lipids. Yet these transformations are orchestrated within highly organized compartments defined by phospholipid bilayers of only a few nanometers thick. These membranes are far more than passive barriers; they enable selective transport, spatial organization, and continuous remodeling, thereby supporting essential processes such as signaling, metabolism, and replication across a range of length scales, from nanometers to entire cellular architectures. In this thesis, I draw inspiration from these natural architectures to investigate how OOE processes of living cells can be incorporated into the design of synthetic phospholipid vesicles to achieve life-like features. By integrating metabolic-like fueling strategies, the work demonstrates how artificial membranes can be generated, remodeled, and functionally sustained, offering insights into the design of adaptive systems for applications in nanomedicine. In essence, these dynamic vesicles follow the philosophy of being “of biology, by biology, for biology,” as they are inspired by cellular processes, operate through life-like principles, and aim to engage more effectively with biological systems. Hence, this thesis aims to push systems chemistry towards biology, focusing on how fuel-driven reaction networks can generate and remodel phospholipid compartments that are central to life itself.

Chapter 1 provides a comprehensive literature survey on vesicular self-assembly under OOE conditions. It begins with the basic principles of chemically fueled OOE cellular membranes, highlighting how biological processes rely on continuous energy dissipation to maintain dynamic structures and functions. The chapter then briefly reviews synthetic vesicles under equilibrium conditions, which have long served as models for membrane formation but remain inherently static in nature, i.e., under thermodynamic control. Here, we will mainly highlight vesicular assemblies that emerge from in situ lipid-forming systems in aqueous media, generated through chemical reactions between simple water-soluble precursors. The discussion then shifts to recent advances in fuel-driven strategies for the formation of vesicles under OOE, covering both 1) non-phospholipid systems that showcase the breadth of dissipative chemistry and 2) phospholipid-based systems that most closely resemble natural membranes. Together, these studies set the stage for the design of synthetic lipid systems with adaptive, life-like features and thereby laying the conceptual groundwork for the experimental work described in the following chapters.

Chapter 2 describes the chemically fueled, OOE self-assembly of synthetic phospholipids into vesicles inspired by the metabolic processes in natural membranes. In living systems, phospholipid turnover is continuously regulated by metabolic cycles that consume fuel to regulate lipid synthesis and degradation, thereby controlling membrane properties. Drawing inspiration from this principle, we developed a minimal chemical reaction network in which simple, water-soluble precursors undergo fuel-driven transformation into double-tailed phospholipids that spontaneously self-assemble into vesicles. Crucially, these assemblies are transient; their lifetime can be tuned from minutes to hours by modulating the kinetic competition between anabolic-like formation and enzymatic catabolism. Beyond their fundamental significance, these nanoscale vesicles offer translational potential through the encapsulation and regulated release of cargo molecules under OOE conditions, opening avenues for adaptive nanomedicine and controlled drug delivery. This chapter represents a cornerstone of the thesis, establishing that phospholipid-based vesicles can indeed be sustained and controlled by artificial metabolic cycles.

Chapter 3 extends this concept to the membrane formation and OOE membrane remodeling of phospholipid vesicles. Here, we systematically varied the hydrophobic tails of lipid precursors and uncovered how tail length directly influences membrane formation. Longer hydrophobic chains accelerated vesicle formation, while shorter chains slowed the process. We also allowed the system to compete and self-select by mixing different fuels, thereby revealing the inherent preferences of lipid assembly. Under equilibrium conditions, the system always converged to a mixed population of asymmetric lipids, giving rise to uniquely shaped compartments. In contrast, under dissipative conditions, kinetic asymmetries reshaped the outcome where fast forming lipid species were rapidly depleted, biasing the system towards distinct lipid populations. This chapter highlights, for the first time, how simple chemical design coupled with non-equilibrium conditions can emulate the adaptive remodelling of biological membranes.

Finally, Chapter 4 presents an overall summary of the work. It also, provides an outlook on how these findings can be applied toward the generation of more integrated, artificial cellular systems. By combining lipid metabolism with other synthetic reaction networks, it may become possible to design compartments that grow, divide, and remodel in response to external stimuli. Such advances would not only shed light on the chemical origins of life but also pave the way for engineering soft, adaptive materials for nanomedicine. Also, this chapter discusses the challenges of this field, more specifically related to the characterization of dynamic supramolecular events in solution, and highlights the importance of the real-time, in situ visualization of these dynamic supramolecular systems.

[cat] Aquesta tesi se centra en el disseny, la síntesi i l’aplicació de fosfolípids fora de l’equilibri (OOE) construïts a partir de blocs de construcció simples i solubles en aigua. Els fosfolípids són amfífils fonamentals que s’organitzen espontàniament en membranes supramoleculars, proporcionant l’estructura i el marc funcional de totes les cèl·lules vives. La vida mateixa depèn de la transformació química i física de diverses biomolècules com proteïnes, àcids nucleics, carbohidrats i lípids. Tot i així, aquestes transformacions es duen a terme dins de compartiments altament organitzats definits per bicapas fosfolipídiques de només uns pocs nanòmetres de gruix. Aquestes membranes són molt més que simples barreres passives; permeten el transport selectiu, l’organització espacial i la remodelació contínua, donant suport a processos essencials com la senyalització, el metabolisme i la replicació a escales que van dels nanòmetres fins a arquitectures cel·lulars senceres. En aquesta tesi, m’inspiro en aquestes arquitectures naturals per investigar com els processos fora de l’equilibri de les cèl·lules vives poden incorporar-se en el disseny de vesícules fosfolipídiques sintètiques per obtenir característiques semblants a la vida. Integrant estratègies de subministrament de combustible semblants al metabolisme, el treball demostra com es poden generar, remodelar i mantenir funcionalment membranes artificials, aportant idees per al disseny de sistemes adaptatius amb aplicacions en nanomedicina. En essència, aquestes vesícules dinàmiques segueixen la filosofia de ser «de la biologia, per la biologia i per a la biologia», ja que s’inspiren en processos cel·lulars, operen mitjançant principis semblants als de la vida i pretenen interactuar de manera més eficaç amb els sistemes biològics. Així doncs, aquesta tesi pretén portar la química de sistemes cap a la biologia, centrant-se en com les xarxes de reaccions impulsades per combustible poden generar i remodelar compartiments fosfolipídics que són centrals per a la vida mateixa.

Capítol 1 ofereix una revisió exhaustiva de la bibliografia sobre l’autoassemblatge vesicular en condicions fora de l’equilibri (OOE). Comença amb els principis bàsics de membranes cel·lulars químiques fora de l’equilibri, destacant com els processos biològics depenen de la dissipació contínua d’energia per mantenir estructures i funcions dinàmiques. El capítol revisa breument les vesícules sintètiques en condicions d’equilibri, que durant molt de temps han servit de models per a la formació de membranes, però que romanen intrínsecament estàtiques sota control termodinàmic. Aquí, ens centrarem sobretot en les estructures vesiculars que emergeixen de sistemes in situ de formació de lípids en medis aquosos, generats mitjançant reaccions químiques entre precursors senzills i solubles en aigua. Aquest capítol també discuteix avenços recents en estratègies impulsades per combustible per a la formació de vesícules en condicions OOE, cobrint tant 1) sistemes no fosfolipídics que mostren l’amplitud de la química dissipativa com 2) sistemes basats en fosfolípids que s’assemblen més a les membranes naturals. Junts, aquests estudis preparen

el terreny per al disseny de sistemes lipídics sintètics amb característiques adaptatives semblants a les de la vida, establint les bases conceptuals per al treball experimental descrit als capítols següents.

Capítol 2 descriu l’autoassemblatge químicament impulsat i fora de l’equilibri de fosfolípids sintètics en vesícules inspirades en processos metabòlics de membranes naturals. En sistemes vius, el recanvi de fosfolípids està regulat contínuament per cicles metabòlics que consumeixen combustible per controlar la síntesi i la degradació lipídica, modulant així les propietats de la membrana. Inspirant-nos en aquest principi, vam desenvolupar una xarxa química mínima en la qual precursors senzills i solubles en aigua es transformen, mitjançant combustible, en fosfolípids de doble cua que s’autoassemblen espontàniament en vesícules. Crucialment, aquests conjunts són transitoris; la seva vida mitjana pot ajustar-se de minuts a hores modulant la competència cinètica entre la formació anabòlica i el catabolisme enzimàtic. Més enllà del seu significat fonamental, aquestes vesícules a nanoescala ofereixen potencial translacional mitjançant l’encapsulació i l’alliberament regulat de càrregues sota condicions OOE, obrint vies per a nanomedicina adaptativa i administració de fàrmacs controlada. Aquest capítol representa una pedra angular de la tesi, establint que les vesícules basades en fosfolípids poden ser sostingudes i controlades mitjançant cicles metabòlics artificials.

Capítol 3 amplia aquest concepte a la formació de membranes i la remodelació fora de l’equilibri de vesícules fosfolipídiques. Aquí, vam variar sistemàticament les cues hidrofòbiques dels precursors lipídics i vam descobrir com la longitud de la cua influeix directament en la formació de membranes. Les cadenes hidrofòbiques més llargues van accelerar la formació de vesícules, mentre que les més curtes van alentir el procés. També vam permetre que el sistema competís i s’autoseleccionés mitjançant la barreja de diferents combustibles, revelant així les preferències inherents de l’assemblatge lipídic. En condicions d’equilibri, el sistema sempre convergia cap a una població mixta de lípids asimètrics que donaven lloc a compartiments amb formes úniques. En canvi, en condicions dissipatives, les asimetries cinètiques van remodelar el resultat, ja que les espècies de formació ràpida es van esgotar ràpidament, inclinant el sistema cap a poblacions lipídiques distintes. Aquest capítol destaca, per primera vegada, com un disseny químic senzill combinat amb condicions fora de l’equilibri pot emular la remodelació adaptativa de membranes biològiques.

Finalment, el Capítol 4 ofereix una perspectiva sobre com aquests resultats poden aplicar-se a la generació de sistemes cel·lulars artificials més integrats. Combinant el metabolisme lipídic amb altres xarxes de reaccions sintètiques, podria ser possible dissenyar compartiments que creixin, es divideixin i es remodelin en resposta a estímuls externs. Aquests avenços no només aportarien llum sobre els orígens químics de la vida, sinó que també obririen el camí per enginyar materials tous i

adaptatius per a la nanomedicina. Aquest capítol també discuteix els reptes d’aquest camp, especialment relacionats amb la caracterització d’esdeveniments supramoleculars dinàmics en solució, i subratlla la importància de la visualització en temps real i in situ d’aquests sistemes supramoleculars dinàmics.