Fitxers
Tipus de document
TesiVersió
Versió publicadaData de publicació
Llicència de publicació
Si us plau utilitzeu sempre aquest identificador per citar o enllaçar aquest document: https://hdl.handle.net/2445/230587
Characterization of a Drosophila Model of Ewing Sarcoma
Títol de la revista
Autors
Director/Tutor
Contribució addicional
ISSN de la revista
Títol del volum
Resum
[eng] Ewing sarcoma (EwS) is a cancer that arises in the bones and soft tissues, and is driven by a single genetic lesion, most commonly the Ewing’s sarcoma breakpoint region 1-Friend leukaemia virus integration 1 (EWS::FLI1) fusion oncogene. Implementation of genetically modified animal models of EwS has proved difficult largely owing to EWS::FLI’s high toxicity. The EWS::FLI11FS frameshift variant that circumvents toxicity but is still able to perform key oncogenic functions provided the first study model in Drosophila. However, the quest for Drosophila lines expressing full-length, unmodified EWS::FLI1 remained open. Here, we show that EWS::FLI11FS’s lower toxicity is owed to reduced protein levels caused by its frameshifted C-terminal peptide, and report new strategies through which we have generated Drosophila lines that express full-length, unmodified EWS::FLI1. Using these lines, we have found that the upregulation of transcription from GGAA-microsatellites (GGAAµSats) presents a positive linear correlation within a wide range of EWS::FLI1 protein concentrations. In contrast, rather counterintuitively, GGAAµSats-independent transcriptomic dysregulation presents relatively minor differences across the same range, suggesting that GGAAµSat-dependent and -independent transcriptional upregulation present different kinetics of response with regards to changing EWS::FLI1 protein concentration. Our results underpin the functional relevance of varying EWS::FLI1 expression levels and provide experimental tools to investigate, in Drosophila, the effect of the EWS::FLI1 ‘high’ and ‘low’ states that have been reported and are suspected to be important for EwS in humans.
Investigations into EWS::FLI1 biology have found substantial roles for “chromatin” proteins, i.e. those that either bind or modify the chromatin, as key facilitators of EWS::FLI1 function. However, a systematic evaluation the role of these chromatin proteins in EwS has not been conducted. Using the characterized transgenic lines, we conducted genetic screens to interrogate all Drosophila chromatin proteins with the aim to identify those that can modify EWS::FLI11-driven transcription from GGAAμSats. We identified 6 RNAi lines as high confidence hits, each of which target genes whose human orthologs have reported relevance in EwS cell lines, demonstrating that the mechanism for EWS::FLI1-induced neoenhancer formation is highly conserved in the fly. Amongst the identified hits is protein phosphatase, alphabet (alph). PPM1A, the mammalian orthologs of alph, was previously reported to facilitate EWS::FLI1-driven transcription from GGAAμSats in EwS cells. My results further suggest EWS::FLI11-driven transcription from GGAAμSats is dependent on the phosphatase activity of alph.
[cat] El sarcoma d’Ewing (EwS) és un càncer que s’origina als ossos i als teixits tous, i que està impulsat per una única lesió genètica, essent la més comuna l’oncogen de fusió Ewing’s sarcoma breakpoint region 1-Friend leukemia virus integration 1 (EWS::FLI1). La implementació de models animals modificats genèticament d’EwS ha resultat difícil sobretot a causa de l’alta toxicitat d’EWS::FLI1. La variant de canvi de pauta de lectura EWS::FLI11FS, que evita la toxicitat però és encara capaç de dur a terme funcions oncogèniques clau, va proporcionar el primer model d’estudi en Drosophila. Tot i així, la recerca de línies de Drosophila amb l’expressió de l’oncogen EWS::FLI11 sencer i no modificat persistia. En aquesta tesi mostrem que la menor toxicitat d’EWS::FLI11FS es deu als nivells reduïts de proteïna, causats pel seu corresponent pèptid C-terminal amb canvi de pauta, i reportem noves estratègies amb les quals hem generat línies de Drosophila que expressen EWS::FLI11 sencer i no modificat. Amb l’ús d’aquestes línies hem descobert que la regulació a l’alça de la transcripció de microsatèl·lits GGAA (GGAAµSats) presenta una correlació lineal positiva dins d’un ampli rang de concentracions de proteïna EWS::FLI11. En canvi, de manera força contraintuïtiva, la desregulació transcriptòmica independent dels GGAAµSats mostra diferències relativament menors dins el mateix rang, suggerint que la regulació transcriptòmica dependent i independent dels GGAAµSats presenta diferents cinètiques de resposta respecte els canvis en la concentració de la proteïna EWS::FLI11. Els nostres resultats donen suport a la rellevància funcional que suposen les variacions en els nivells d’expressió d’EWS::FLI11, i proporcionen eines experimentals per investigar, en Drosophila, l’efecte dels estats “alts” i “baixos” d’EWS::FLI11 que s’han reportat i que se sospita que són importants per a l’EwS en humans. Diverses investigacions sobre la biologia d’EWS::FLI1 han descrit rols substancials per a les proteïnes de la cromatina, és a dir, aquelles que s’uneixen o modifiquen la cromatina, com a facilitadores clau de la funció d’EWS::FLI1. No obstant, no s’ha dut a terme una avaluació sistemàtica sobre el paper d’aquestes proteïnes de la cromatina en l’EwS. Mitjançant l’ús de les línies transgèniques caracteritzades, hem realitzat cribratges genètics per interrogar totes les proteïnes de la cromatina de Drosophila amb l’objectiu d’identificar aquelles que poden modificar la transcripció impulsada per EWS::FLI11 des dels GGAAµSats. Hem identificat 6 línies d’ARNi com a resultats d’alta confiança, cadascuna de les quals té com a diana gens els ortòlegs dels quals s’ha reportat una rellevància en línies cel·lulars d’EwS, demostrant que el mecanisme de formació d’amplificadors genètics neo induïda per EWS::FLI1 està altament conservat en la mosca. Entre els resultats identificats hi ha la fosfatasa proteica alphabet (alph). PPM1A, l’ortòleg mamífer d’alph, ja havia estat reportat com a facilitador de la transcripció impulsada per EWS::FLI1 des dels GGAAµSats en cèl·lules d’EwS. Els meus resultats suggereixen, a més, que la transcripció impulsada per EWS::FLI11 des dels GGAAµSats depèn de l’activitat fosfatasa d’alph.
[cat] El sarcoma d’Ewing (EwS) és un càncer que s’origina als ossos i als teixits tous, i que està impulsat per una única lesió genètica, essent la més comuna l’oncogen de fusió Ewing’s sarcoma breakpoint region 1-Friend leukemia virus integration 1 (EWS::FLI1). La implementació de models animals modificats genèticament d’EwS ha resultat difícil sobretot a causa de l’alta toxicitat d’EWS::FLI1. La variant de canvi de pauta de lectura EWS::FLI11FS, que evita la toxicitat però és encara capaç de dur a terme funcions oncogèniques clau, va proporcionar el primer model d’estudi en Drosophila. Tot i així, la recerca de línies de Drosophila amb l’expressió de l’oncogen EWS::FLI11 sencer i no modificat persistia. En aquesta tesi mostrem que la menor toxicitat d’EWS::FLI11FS es deu als nivells reduïts de proteïna, causats pel seu corresponent pèptid C-terminal amb canvi de pauta, i reportem noves estratègies amb les quals hem generat línies de Drosophila que expressen EWS::FLI11 sencer i no modificat. Amb l’ús d’aquestes línies hem descobert que la regulació a l’alça de la transcripció de microsatèl·lits GGAA (GGAAµSats) presenta una correlació lineal positiva dins d’un ampli rang de concentracions de proteïna EWS::FLI11. En canvi, de manera força contraintuïtiva, la desregulació transcriptòmica independent dels GGAAµSats mostra diferències relativament menors dins el mateix rang, suggerint que la regulació transcriptòmica dependent i independent dels GGAAµSats presenta diferents cinètiques de resposta respecte els canvis en la concentració de la proteïna EWS::FLI11. Els nostres resultats donen suport a la rellevància funcional que suposen les variacions en els nivells d’expressió d’EWS::FLI11, i proporcionen eines experimentals per investigar, en Drosophila, l’efecte dels estats “alts” i “baixos” d’EWS::FLI11 que s’han reportat i que se sospita que són importants per a l’EwS en humans. Diverses investigacions sobre la biologia d’EWS::FLI1 han descrit rols substancials per a les proteïnes de la cromatina, és a dir, aquelles que s’uneixen o modifiquen la cromatina, com a facilitadores clau de la funció d’EWS::FLI1. No obstant, no s’ha dut a terme una avaluació sistemàtica sobre el paper d’aquestes proteïnes de la cromatina en l’EwS. Mitjançant l’ús de les línies transgèniques caracteritzades, hem realitzat cribratges genètics per interrogar totes les proteïnes de la cromatina de Drosophila amb l’objectiu d’identificar aquelles que poden modificar la transcripció impulsada per EWS::FLI11 des dels GGAAµSats. Hem identificat 6 línies d’ARNi com a resultats d’alta confiança, cadascuna de les quals té com a diana gens els ortòlegs dels quals s’ha reportat una rellevància en línies cel·lulars d’EwS, demostrant que el mecanisme de formació d’amplificadors genètics neo induïda per EWS::FLI1 està altament conservat en la mosca. Entre els resultats identificats hi ha la fosfatasa proteica alphabet (alph). PPM1A, l’ortòleg mamífer d’alph, ja havia estat reportat com a facilitador de la transcripció impulsada per EWS::FLI1 des dels GGAAµSats en cèl·lules d’EwS. Els meus resultats suggereixen, a més, que la transcripció impulsada per EWS::FLI11 des dels GGAAµSats depèn de l’activitat fosfatasa d’alph.
Recurs relacionat
Matèries (anglès)
Citació
Col·leccions
Citació
MAHNOOR, Serena. Characterization of a Drosophila Model of Ewing Sarcoma. [consulted: 6 of October of 2026]. Available at: https://hdl.handle.net/2445/230587