Fitxers
Tipus de document
TesiVersió
Versió publicadaData de publicació
Tots els drets reservats
Si us plau utilitzeu sempre aquest identificador per citar o enllaçar aquest document: https://hdl.handle.net/2445/231560
Advanced microscopy for real-time imaging of biological samples
Títol de la revista
Autors
Director/Tutor
Contribució addicional
ISSN de la revista
Títol del volum
Resum
[eng] A central challenge in modern optical microscopy is imaging biological processes that occur on very fast timescales. Ultimately, imaging speed is constrained by the available signal-to-noise ratio (SNR), which is typically low for biological samples, particularly in fluorescence-based imaging. Label-free techniques exist that obviate the need for fluorophores and provide image contrast of optically transparent samples – as in most biological specimens – by measuring the phase changes of light. In this case, a much higher SNR is available, enabling faster imaging, but imaging speed is still limited by technical bottlenecks. These include camera readout times in widefield implementations and the reliance on mechanical scanning in point-by-point detection schemes. As a results, current microscopes remain suboptimal tools to fully characterize dynamic processes as relevant as molecular diffusion, neuronal communications or the rapid evolution of microorganisms.
This thesis focuses on the development of three optical strategies to overcome these speed barriers, with the goal of enabling ultrafast visualization of dynamic biological samples. Two of the systems are based on quantitative phase imaging (QPI), a label-free technique that measures how transparent samples shift the phase of light. Within QPI, the Transport of Intensity Equation (TIE) is a widely used approach: it reconstructs phase information from a set of slightly defocused images. However, acquiring those defocus planes normally requires either mechanically moving the sample or the objective, which is typically too slow for many biological applications. My first system addressed this limitation by introducing a tunable acoustic gradient (TAG) lens and pulsed monochromatic illumination to achieve electronic focus shifting at microsecond time scales. This eliminates the need for mechanical movement, enabling fast sequential acquisition of defocused images and, consequently, much faster TIE phase reconstructions. My second system tackles the same problem from a different angle: it uses chromatic aberration and pulsed red-green-blue (RGB) illumination so that a single snapshot from a color camera already contains the necessary defocus information in its color channels. This makes TIE essentially a single-shot method, achieving reconstructions at up to 150 frames per second.
My third contribution goes beyond a specific imaging technique and directly addresses one of the main bottlenecks of any widefield optical microscope: slow camera readout time. In this case, instead of relying on cameras with millions of pixels and imaging rates of hundreds of frames-per-second (fps), I developed a frequency-encoded microscope which features a camera with a single pixel. Here, acousto-optic deflectors scan the sample with rows of light, each tagged with a unique modulation frequency. A single detector records the combined signal, which is then demultiplexed computationally. This bypasses the speed limits of cameras and, in principle, enables imaging at hundreds of thousands of fps — opening new possibilities for ultrafast studies, particularly in label-free systems with an intrinsically high SNR.
Taken together, these three systems demonstrate a consistent theme: using acousto-optic devices and clever optical encoding to achieve speed gains that traditional microscopes cannot reach. They point toward a new generation of ultrafast microscopy tools, combining the quantitative insights of phase imaging with light-control strategies for characterizing biological samples with an unprecedented spatiotemporal detail.
[cat] Un dels principals reptes de la microscòpia òptica moderna és la imatge de processos biològics que tenen lloc en escales temporals molt ràpides. En última instància, la velocitat d’imatge està limitada per la relació senyal-soroll (SNR) disponible, que acostuma a ser baixa en mostres biològiques, especialment en la imatge basada en fluorescència. Existeixen tècniques sense marcatge que eviten la necessitat de fluoròfors i proporcionen contrast d’imatge en mostres òpticament transparents —com passa en la majoria d’espècimens biològics— mitjançant la mesura dels canvis de fase de la llum. En aquest cas, es disposa d’una SNR molt més elevada, fet que permet una imatge més ràpida, però la velocitat continua estant limitada per colls d’ampolla tècnics. Aquests inclouen els temps de lectura de les càmeres en implementacions de camp ampli i la dependència de l’escaneig mecànic en esquemes de detecció punt a punt. Com a resultat, els microscopis actuals continuen sent eines subòptimes per caracteritzar completament processos dinàmics tan rellevants com la difusió molecular, la comunicació neuronal o l’evolució ràpida de microorganismes. Aquesta tesi se centra en el desenvolupament de tres estratègies òptiques per superar aquestes barreres de velocitat, amb l’objectiu de permetre la visualització ultraràpida de mostres biològiques dinàmiques. Dos dels sistemes es basen en la imatge de fase quantitativa (QPI), una tècnica sense marcatge que mesura com les mostres transparents desplacen la fase de la llum. Dins de la QPI, l’Equació de Transport de la Intensitat (TIE) és un enfocament àmpliament utilitzat: reconstrueix la informació de fase a partir d’un conjunt d’imatges lleugerament desenfocades. No obstant això, l’adquisició d’aquests plans de desenfocament requereix normalment el moviment mecànic de la mostra o de l’objectiu, cosa que acostuma a ser massa lenta per a moltes aplicacions biològiques. El meu primer sistema va abordar aquesta limitació introduint una lent de gradient acústic sintonitzable (TAG) i il·luminació monocromàtica polsada per aconseguir un desplaçament electrònic del focus en escales temporals de microsegons. Això elimina la necessitat de moviment mecànic, permetent l’adquisició seqüencial ràpida d’imatges desenfocades i, en conseqüència, reconstruccions de fase TIE molt més ràpides. El meu segon sistema afronta el mateix problema des d’un angle diferent: utilitza l’aberració cromàtica i il·luminació polsada vermella-verda-blava (RGB) de manera que una sola captura amb una càmera en color ja conté la informació de desenfocament necessària en els seus canals de color. Això converteix la TIE essencialment en un mètode d’una sola presa, assolint reconstruccions de fins a 150 fotogrames per segon. La meva tercera contribució va més enllà d’una tècnica d’imatge específica i aborda directament un dels principals colls d’ampolla de qualsevol microscopi òptic de camp ampli: el temps lent de lectura de les càmeres. En aquest cas, en lloc de dependre de càmeres amb milions de píxels i velocitats d’imatge de centenars de fotogrames per segon (fps), vaig desenvolupar un microscopi codificat en freqüència que incorpora una càmera amb un sol píxel. Aquí, els deflectors acustoòptics escanegen la mostra amb files de llum, cadascuna etiquetada amb una freqüència de modulació única. Un únic detector registra el senyal combinat, que posteriorment es desmultiplexa computacionalment. Això evita els límits de velocitat de les càmeres i, en principi, permet la imatge a centenars de milers de fps, obrint noves possibilitats per a estudis ultraràpids, especialment en sistemes sense marcatge amb una SNR intrínsecament elevada. En conjunt, aquests tres sistemes demostren un fil conductor clar: l’ús de dispositius acustoòptics i d’estratègies d’encodatge òptic intel·ligents per aconseguir guanys de velocitat que els microscopis tradicionals no poden assolir. Apunten cap a una nova generació d’eines de microscòpia ultraràpida, que combinen les aportacions quantitatives de la imatge de fase amb estratègies avançades de control de la llum per caracteritzar mostres biològiques amb un nivell de detall espaiotemporal sense precedents.
[cat] Un dels principals reptes de la microscòpia òptica moderna és la imatge de processos biològics que tenen lloc en escales temporals molt ràpides. En última instància, la velocitat d’imatge està limitada per la relació senyal-soroll (SNR) disponible, que acostuma a ser baixa en mostres biològiques, especialment en la imatge basada en fluorescència. Existeixen tècniques sense marcatge que eviten la necessitat de fluoròfors i proporcionen contrast d’imatge en mostres òpticament transparents —com passa en la majoria d’espècimens biològics— mitjançant la mesura dels canvis de fase de la llum. En aquest cas, es disposa d’una SNR molt més elevada, fet que permet una imatge més ràpida, però la velocitat continua estant limitada per colls d’ampolla tècnics. Aquests inclouen els temps de lectura de les càmeres en implementacions de camp ampli i la dependència de l’escaneig mecànic en esquemes de detecció punt a punt. Com a resultat, els microscopis actuals continuen sent eines subòptimes per caracteritzar completament processos dinàmics tan rellevants com la difusió molecular, la comunicació neuronal o l’evolució ràpida de microorganismes. Aquesta tesi se centra en el desenvolupament de tres estratègies òptiques per superar aquestes barreres de velocitat, amb l’objectiu de permetre la visualització ultraràpida de mostres biològiques dinàmiques. Dos dels sistemes es basen en la imatge de fase quantitativa (QPI), una tècnica sense marcatge que mesura com les mostres transparents desplacen la fase de la llum. Dins de la QPI, l’Equació de Transport de la Intensitat (TIE) és un enfocament àmpliament utilitzat: reconstrueix la informació de fase a partir d’un conjunt d’imatges lleugerament desenfocades. No obstant això, l’adquisició d’aquests plans de desenfocament requereix normalment el moviment mecànic de la mostra o de l’objectiu, cosa que acostuma a ser massa lenta per a moltes aplicacions biològiques. El meu primer sistema va abordar aquesta limitació introduint una lent de gradient acústic sintonitzable (TAG) i il·luminació monocromàtica polsada per aconseguir un desplaçament electrònic del focus en escales temporals de microsegons. Això elimina la necessitat de moviment mecànic, permetent l’adquisició seqüencial ràpida d’imatges desenfocades i, en conseqüència, reconstruccions de fase TIE molt més ràpides. El meu segon sistema afronta el mateix problema des d’un angle diferent: utilitza l’aberració cromàtica i il·luminació polsada vermella-verda-blava (RGB) de manera que una sola captura amb una càmera en color ja conté la informació de desenfocament necessària en els seus canals de color. Això converteix la TIE essencialment en un mètode d’una sola presa, assolint reconstruccions de fins a 150 fotogrames per segon. La meva tercera contribució va més enllà d’una tècnica d’imatge específica i aborda directament un dels principals colls d’ampolla de qualsevol microscopi òptic de camp ampli: el temps lent de lectura de les càmeres. En aquest cas, en lloc de dependre de càmeres amb milions de píxels i velocitats d’imatge de centenars de fotogrames per segon (fps), vaig desenvolupar un microscopi codificat en freqüència que incorpora una càmera amb un sol píxel. Aquí, els deflectors acustoòptics escanegen la mostra amb files de llum, cadascuna etiquetada amb una freqüència de modulació única. Un únic detector registra el senyal combinat, que posteriorment es desmultiplexa computacionalment. Això evita els límits de velocitat de les càmeres i, en principi, permet la imatge a centenars de milers de fps, obrint noves possibilitats per a estudis ultraràpids, especialment en sistemes sense marcatge amb una SNR intrínsecament elevada. En conjunt, aquests tres sistemes demostren un fil conductor clar: l’ús de dispositius acustoòptics i d’estratègies d’encodatge òptic intel·ligents per aconseguir guanys de velocitat que els microscopis tradicionals no poden assolir. Apunten cap a una nova generació d’eines de microscòpia ultraràpida, que combinen les aportacions quantitatives de la imatge de fase amb estratègies avançades de control de la llum per caracteritzar mostres biològiques amb un nivell de detall espaiotemporal sense precedents.
Recurs relacionat
Matèries
Matèries (anglès)
Citació
Col·leccions
Citació
ALEXANDROPOULOS, Christos. Advanced microscopy for real-time imaging of biological samples. [consulted: 3 of October of 2026]. Available at: https://hdl.handle.net/2445/231560