Glicogen sintasa muscular: elements de control de la distribució subcel·lular i identificació de residus crítics per a la catàlisi.

Abstract

[cat] La glicogen sintasa muscular és un enzim altament regulat. Aquesta tesi doctoral ha aprofondit en diversos aspectes no resolts com la descripció del seu mecanisme catalític i les relacions estructura-funció o la distribució subcel·lular de l'enzim. Així doncs aquesta tesi doctoral ha combinat diferents tècniques, ja siguin bioinformàtiques, bioquímiques i de biologia cel·lular i molecular i els resultats obtinguts es resumeixen en els següents paràgrafs. Els resultats de la comparació de les glicogen (midó) sintases i les glicogen sintases indiquen que a més de catalitzar la mateixa reacció, la síntesi de ?(1?4)-glucà, comparteixen característiques similars així com zones d'estructura secundària predita homòlogues. Per tant podrien incloure's en una mateixa "superfamília". A més es detectà que les glicogen (midó) sintases d'arqueobacteris són filogenèticament properes a les glicogen sintases de fongs i mamífers. Endemés d'ésser similars a nivell de seqüència i estructura secundària predita presenten una especificitat de substrat semblant i una mida més reduïda. Per tant són bons models per a estudiar a nivell estructural tant les glicogen sintases com les glicogen (midó) sintases. També s'ha demostrat que el residu Glu-510 de la HsMGS és essencial per a la catàlisi i el Glu-518 hi juga un paper important però secundari. Proposem que els equivalent d'aquests residus en les glicosiltransferases de les famílies 4, 5, i 15 també són fonamentals en el mecanisme de catàlisi. La glicogen sintasa muscular de mamífers presenta una localització subcel·lular regulada entre el nucli i el citoplasma. Aquesta translocació no és exclusiva de l'enzim humà ni de les cèl·lules de tipus muscular ja que també es presenta la línia cel·lular 3T3-L1, un model d'adipòcits de ratolí. Ni la sobreexpressió ni la fusió de l'enzim a GFP alteren aquesta distribució regulada. Endemés quan se sobreexpressa la glicogen sintasa muscular en cèl·lules que no la expressen també es manté la distribució regulada. De diferents experiments de mutagènesi dirigida també s'ha observat que la glucosa 6-fosfat juga un paper estimulador en l'export des del nucli de la HsMGS. L'augment de la concentració de glucosa 6-fosfat és necessaria per afavorir la seva localització correcta a l'hora de sintetitzar glicogen, per tal de fornir de substrat i per activar a la glicogen sintasa. La concentració de la HsMGS en el nucli es produeix en resposta a la depleció del glicogen intracel·lular. El glicogen realitzaria una funció de retenció de la proteïna en el citoplasma impedint-ne la seva translocació al nucli. Dins del nucli la HsMGS forma agregacions esfèriques que es distribueixen pel nucleoplasma. Aquestes agrupacions col·localitzen amb p80-coilina i PML. La capacitat de l'enzim de catalitzar la síntesi de l'?(1?4)-glucà no és necessària per al control de la localització subcel·lular, ja que el mutant Glu-510 (catalíticament incapaç) es distribueix en la cèl·lula de la mateixa forma que l'enzim salvatge. La fosforilació i desfosforilació dels llocs descrits que controlen l'activitat de la HsMGS no regulen la distribució subcel·lular d'aquest enzim. Malgrat això, existeixen certes evidències que d'altres residus no identificats es fosforilen, i tenint en compte que el transport nucleocitoplasmàtic es regula molt freqüentment mitjançant fosforilació-desfosforilació, seria possible que aquests nous llocs controlessin en alguna mesura la translocació de la HsMGS. Finalment també s'ha demostrat que l'export nuclear de la HsMGS està mediat per la via clàssica d'export, que és leptomicina B sensible.