Deciphering transcript usage interindividual variation across human tissues and immune responses

Abstract

[eng] Transcript usage (TU) —the expression of alternative isoforms from the same gene— is a transcriptional regulatory mechanism that vastly expands the functional complexity of the human transcriptome and proteome. TU regulates virtually all cellular processes, from cell differentiation and development to disease and immune response. While TU during immune activation has been investigated in individual cell types, a systematic characterization across all immune lineages under pathogenic stimulation is still missing, leaving fundamental aspects of immune regulation unresolved. TU also shows pronounced interindividual variation, particularly across human populations, yet both the extent of this diversity and its functional consequences remain poorly understood. This thesis addresses these research gaps by investigating the role of TU in human phenotypic variation, with an emphasis on antiviral immunity. To this end, it introduces novel computational strategies for the studying TU variation in health and during immune response and shows its application to large-scale bulk and single-cell transcriptomic datasets.

The thesis is structured into two main chapters. Chapter 1 presents a computational pipeline to infer the functional consequences of TU by mapping alternative splicing events to protein domains. Using a large-cohort dataset, we quantified interindividual splicing variation by demographic traits such as sex, age, ancestry, and BMI across multiple tissues, and then functionally interpreted these differences with our pipeline. Our analysis revealed that a large fraction of interindividual splicing differences affect a protein domain, suggesting potential implications over protein activity. Additionally, we identified functional ancestry-associated splicing differences affecting ribosomal proteins, raising the possibility that elements of the translational machinery vary systematically between human populations. Overall, our computational method reveals valuable insights into the functional implications of interindividual TU variation across demographic traits.

Chapter 2 constitutes the central contribution of this thesis: the first comprehensive single-cell atlas of TU variation in the immune response to viral infection. We developed a novel strategy for DTU and TU-QTL analyses tailored to tag-end single-cell RNA-seq data, the only current modality offering sufficient sample sizes to study TU variation across immune lineages. To address the strong 3′/5′ coverage bias of these protocols, we quantified TU through equivalence classes, enabling unambiguous mapping of reads to transcript structures. Applying this framework to a dataset of 770,000 peripheral blood mononuclear cells from 160 European and African donors, both at baseline and after influenza A or SARS-CoV-2 infection, we demonstrated that viral stimulation increases isoform diversity and drives extensive remodelling of the transcriptome across immune cell types. We further explored genetic regulation by mapping TU-QTLs, which account for a substantial fraction of population-level TU differences. Importantly, we identified response TU-QTLs—variants whose effects arise only after infection—with most being virus-specific, highlighting the context-dependent nature of TU genetic regulation. A central finding of this chapter is the limited overlap between TU and overall gene expression differences, underscoring TU as an independent regulatory layer that must be considered to fully capture transcriptional immune variation. Overall, this work not only positions TU as a central regulator of antiviral immunity across cell-types but also lays the foundation for future research linking interindividual TU variation in immune response with variation in clinical outcome to viral infection.

By developing novel computational approaches and applying them to large-scale datasets, this thesis delivers a comprehensive view of interindividual TU variation in both healthy and stimulated contexts. It emphasizes TU as a crucial layer of transcriptomic regulation, shaping phenotypic diversity and immune responses. These findings carry broad implications for understanding the molecular mechanisms underlying human variability in infection outcomes and lay the groundwork for future studies connecting TU to disease susceptibility, therapeutic responses, and precision medicine.

[cat] L’ús de transcript (TU) —l’expressió d’isoformes alternatives d’un mateix gen—és un mecanisme de regulació transcripcional que expandeix la complexitat funcional del transcriptoma i el proteoma humans. El TU regula pràcticament tots els processos cel·lulars, des de la diferenciació i el desenvolupament fins a la malaltia i la resposta immune. Tot i que el TU durant l’activació immune s’ha investigat en tipus cel·lulars concrets, encara manca una caracterització sistemàtica a través de totes les línies immunes sota estimulació patogènica, deixant sense resoldre aspectes fonamentals de la regulació immune. El TU també mostra una variació interindividual marcada, especialment entre poblacions humanes, però tant l’abast d’aquesta diversitat com les seues implicacions funcionals romanen poc estudiades. Aquesta tesi aborda aquests buits investigant el paper del TU en la variació fenotípica humana, amb un èmfasi especial en la immunitat antiviral. Per fer-ho, introdueix estratègies computacionals noves per estudiar la variació del TU en salut i durant la resposta immune, i en mostra l’aplicació en conjunts de dades transcriptòmiques massives de tipus bulk i d’una sola cèl·lula. La tesi s’estructura en dos capítols principals. El Capítol 1 presenta un mètode computacional per inferir les conseqüències funcionals del TU mitjançant l’associació d’events d’splicing alternatiu a dominis de proteïna. Utilitzant un dades d’una gran cohort d’individus, vam quantificar la variació interindividual d’splicing segons trets demogràfics com sexe, edat, ascendència genètic i IMC a través de múltiples teixits, i després vam aplicar el nostre mètode per interpretar funcionalment aquestes diferències. La nostra anàlisi va revelar que una gran fracció de les diferències d’splicing interindividuals afecten un domini proteic, cosa que suggereix possibles implicacions en l’activitat de la proteïna. A més, vam identificar diferències funcionals d’splicing entre poblacions que afecten proteïnes ribosomals, la plantejant la possibilitat que alguns elements de la maquinària translacional varien sistemàticament entre poblacions humanes. En conjunt, el nostre mètode computacional aporta informació valuosa sobre les implicacions funcionals de la variació interindividual del TU a través de trets demogràfics.

El Capítol 2 constitueix l’aportació central d’aquesta tesi: el primer atles complet a nivell de cèl·lula única de la variació del TU en la resposta immune a la infecció viral. Hem desenvolupat una estratègia nova per diferències en TU i variants genètiques que alteren el TU (TU-QTLs) adaptada a dades de RNA-seq d’una sola cèl·lula de tipus tag-end, l’única modalitat actual que ofereix la mida mostral suficient per estudiar la variació del TU a través de les línies immunes. Per abordar el fort biaix de cobertura 3′/5′ d’aquests protocols, vam quantificar el TU mitjançant classes d’equivalència, fet que permet assignar de manera no ambigua les lectures de seqüenciació a transcripts. Aplicant aquest a estratègia a un conjunt de dades de 770.000 cèl·lules mononuclears de sang perifèrica de 160 donants europeus i africans, tant en condicions basals com després d’infecció per grip A o SARS-CoV-2, vam demostrar que l’estimulació viral incrementa la diversitat d’isoformes i indueix un remodelatge extens del transcriptoma a través dels tipus cel·lulars immunes. També vam explorar la regulació genètica mitjançant el mapatge de TU-QTLs, que expliquen una fracció substancial de les diferències de TU a nivell poblacional. És especialment rellevant la identificació de TU-QTLs de resposta —variants els efectes de les quals només emergeixen després de la infecció—, la majoria dels quals són específics del virus, ressaltant la naturalesa dependent del context de la regulació genètica del TU. Una troballa clau d’aquest capítol és la superposició limitada entre canvis de TU i de l’expressió gènica global, subratllant el TU com una capa reguladora independent que cal considerar per capturar completament la variació transcripcional immune. En conjunt, aquest treball no només situa el TU com a regulador central de la immunitat antiviral a resolució de tipus cel·lular, sinó que també estableix les bases per a investigacions futures que connectin la variació interindividual del TU en la resposta immune amb la variabilitat clínica davant d’infeccions virals.

En desenvolupar enfocaments computacionals nous i aplicar-los a conjunts de dades massius, aquesta tesi ofereix una visió completa de la variació interindividual del TU tant en contextos sans com estimulats. Ressalta el TU com una capa crucial de regulació transcriptòmica que modela la diversitat fenotípica i les respostes immunes. Aquestes troballes tenen implicacions àmplies per a la comprensió dels mecanismes moleculars subjacents a la variabilitat humana en els resultats d’infecció i estableixen les bases per a futurs estudis que connecten el TU amb la susceptibilitat a malalties, les respostes terapèutiques i la medicina de precisió.

El uso de transcrito (TU) —la expresión de isoformas alternativas de un mismo gen— es un mecanismo de regulación transcripcional que expande la complejidad funcional del transcriptoma y el proteoma humanos. El TU regula prácticamente todos los procesos celulares, desde la diferenciación y el desarrollo hasta la enfermedad y la respuesta inmune. Aunque el TU durante la activación inmune se ha investigado en tipos celulares concretos, todavía falta una caracterización sistemática a través de todas las líneas inmunes bajo estimulación patogénica, lo que deja sin resolver aspectos fundamentales de la regulación inmune. El TU también muestra una variación interindividual marcada, especialmente entre poblaciones humanas, pero tanto el alcance de esta diversidad como sus implicaciones funcionales permanecen poco estudiados. Esta tesis aborda estos déficits investigando el papel del TU en la variación fenotípica humana, con un énfasis especial en la inmunidad antiviral. Para ello, introduce nuevas estrategias computacionales para estudiar la variación del TU en salud y durante la respuesta inmune, y muestra su aplicación en conjuntos de datos transcriptómicos masivos de tipo bulk y de célula única.

La tesis se estructura en dos capítulos principales. El Capítulo 1 presenta un método computacional para inferir las consecuencias funcionales del TU mediante la asociación de eventos de splicing alternativo a dominios proteicos. Utilizando datos de una gran cohorte de individuos, cuantificamos la variación interindividual de splicing según rasgos demográficos como sexo, edad, ascendencia genética e IMC en múltiples tejidos, y después aplicamos nuestro método para interpretar funcionalmente estas diferencias. Nuestro análisis revela que una gran fracción de las diferencias de splicing interindividuales afectan a un dominio proteico, lo que sugiere posibles implicaciones en la actividad de la proteína. Además, identificamos diferencias funcionales de splicing entre poblaciones que afectan a proteínas ribosomales, planteando la posibilidad de que algunos elementos de la maquinaria translacional varíen sistemáticamente entre poblaciones humanas. En conjunto, nuestro método computacional aporta información valiosa sobre las implicaciones funcionales de la variación interindividual del TU a través de rasgos demográficos.

El Capítulo 2 constituye la aportación central de esta tesis: el primer atlas completo a nivel de célula única de la variación del TU en la respuesta inmune a la infección viral. Hemos desarrollado una estrategia nueva para detectar diferencias en TU y variantes genéticas que alteran el TU (TU-QTLs), adaptada a datos de RNA-seq de célula única de tipo tag-end, la única modalidad actual que ofrece un tamaño muestral suficiente para estudiar la variación del TU a través de las líneas inmunes. Para abordar el fuerte sesgo de cobertura 3′/5′ de estos protocolos, cuantificamos el TU mediante clases de equivalencia, lo que permite asignar de manera no ambigua las lecturas de secuenciación a transcritos. Aplicando esta estrategia a un conjunto de datos de 770.000 células mononucleares de sangre periférica de 160 donantes europeos y africanos, tanto en condiciones basales como después de infección por gripe A o SARS-CoV-2, demostramos que la estimulación viral incrementa la diversidad de isoformas e induce un remodelado extenso del transcriptoma a través de los tipos celulares inmunes. También exploramos la regulación genética mediante el mapeo de TU-QTLs, que explican una fracción sustancial de las diferencias de TU a nivel poblacional. Es especialmente relevante la identificación de TU-QTLs de respuesta —variantes cuyos efectos solo emergen después de la infección—, la mayoría de los cuales son específicos del virus, resaltando la naturaleza dependiente del contexto de la regulación genética del TU. Un hallazgo clave de este capítulo es la superposición limitada entre los cambios de TU y los de la expresión génica global, subrayando al TU como una capa reguladora independiente que debe considerarse para capturar completamente la variación transcripcional inmune. En conjunto, este trabajo no solo sitúa al TU como un regulador central de la inmunidad antiviral a resolución de tipo celular, sino que también establece las bases para investigaciones futuras que conecten la variación interindividual del TU en la respuesta inmune con la variabilidad clínica frente a infecciones virales.

Al desarrollar nuevos enfoques computacionales y aplicarlos a conjuntos de datos masivos, esta tesis ofrece una visión completa de la variación interindividual del TU tanto en contextos sanos como estimulados. Resalta el TU como una capa crucial de regulación transcriptómica que modela la diversidad fenotípica y las respuestas inmunes. Estos hallazgos tienen amplias implicaciones para la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a la variabilidad humana en los resultados de infección y establecen las bases para futuros estudios que conecten el TU con la susceptibilidad a enfermedades, las respuestas terapéuticas y la medicina de precisión.