Enzim diamino oxidasa: noves fonts i aplicacions

Abstract

[cat] L’enzim diamino oxidasa (DAO) és responsable de la degradació intestinal de la histamina i actua com a barrera per prevenir el pas d’aquesta amina cap a la circulació sistèmica. Un dèficit en l’activitat de l’enzim DAO constitueix la principal causa de la intolerància a la histamina. Actualment, el tractament d’aquest trastorn es basa en el seguiment d’una dieta baixa en histamina, tot i que recentment s’ha proposat la suplementació oral amb enzim DAO exogen com a estratègia per afavorir la degradació intestinal de la histamina i millorar la qualitat de vida de les persones afectades degut a que poden seguir una dieta menys restrictiva. La Comissió Europea va autoritzar l’any 2017 l’ús d’enzim DAO procedent de ronyó de porc com a "novel food" i ingredient actiu pels complements destinats a la gestió dietètica d’aquesta intolerància. El fet que alguns estudis hagin detectat aquest enzim en germinats d’espècies vegetals obre la porta a identificar noves fonts d’enzim DAO. L’objectiu general d’aquesta tesi doctoral és aprofundir en el coneixement de les fonts actuals d’enzim DAO, explorar-ne de noves i desenvolupar aplicacions innovadores orientades tant al tractament de la intolerància com a la prevenció de l’acumulació d’histamina i altres amines biògenes en aliments fermentats. Quant a l’optimització de l’activitat enzimàtica DAO de l’extracte proteic de ronyó porcí, es va comprovar que la incorporació d’una etapa prèvia de liofilització de la matèria primera permetia duplicar l’activitat DAO d’aquest ingredient. El control de la temperatura durant el procés d’assecat de l’extracte proteic i l’aplicació de tractaments biocides específics constitueixen factors determinants per garantir la màxima activitat enzimàtica. Pel que fa a les condicions de conservació, l’emmagatzematge en refrigeració va assegurar l’estabilitat de l’activitat DAO durant, com a mínim, 24 mesos. D’entre les diferents espècies vegetals analitzades, els germinats de diverses llavors de la família de les lleguminoses van presentar la major activitat DAO, especialment el cigró, la llentia, la soia i el pèsol. Es va avaluar l’efecte de diversos paràmetres agrotecnològics sobre l’activitat DAO i el rendiment de germinació de les llavors. La desinfecció amb hipoclorit sòdic va permetre millorar notablement la taxa de germinació sense comprometre l’activitat enzimàtica. Igualment, el binomi temps–temperatura va ser clau per assegurar la màxima activitat DAO. En canvi, l’estrès salí no només no va incrementar l’activitat DAO, sinó que va reduir la taxa de germinació. Quant a l’estabilitat durant l’emmagatzematge, només la congelació va resultar eficaç per mantenir intacta l’activitat DAO dels germinats de llegum liofilitzats durant almenys 12 mesos. L’estudi comparatiu dels paràmetres cinètics de l’enzim DAO d’origen animal, vegetal i microbià, va posar de manifest una variabilitat notable tant en l’activitat com en l’afinitat per la histamina. La DAO microbiana, procedent de Yarrowia lipolytica, va presentar l’activitat més elevada, però amb una afinitat molt inferior envers la histamina en comparació amb la DAO animal i vegetal. La DAO procedent de germinats de llegum va ser la única que no va mostrar inhibició per substrat. Finalment, la semivida de la DAO vegetal en condicions intestinals simulades va ser de 60 minuts, enfront els 20-30 minuts de les d’origen animal i microbià. Davant l’auge dels aliments vegetals fermentats, es va avaluar la incorporació de l’ingredient actiu a base de germinats de llegum amb activitat DAO com a estratègia innovadora per controlar l’acumulació d’amines biògenes en aquest tipus de productes. L’addició de germinats de pèsol liofilitzats en xucrut elaborat a escala de laboratori va provocar una reducció significativa dels nivells de putrescina, cadaverina, histamina i tiramina. Aquest efecte es va observar també quan les quatre amines es trobaven simultàniament en la matriu alimentària per simular un escenari més realista. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi doctoral posen de manifest que la DAO d’origen animal i vegetal tenen un ampli potencial d’aplicació en la formulació de complements alimentosos destinats a la gestió dietètica de la intolerància a la histamina. Tanmateix, la DAO procedent de germinats de determinades espècies de lleguminoses ofereix avantatges addicionals, ja que és apte per a una població més àmplia, es pot obtenir de manera més sostenible i aporten un valor afegit addicional a les llavors de lleguminoses. A més, l’addició d’aquest ingredient actiu pot esdevenir una estratègia natural i innovadora per al control del contingut d’amines en aliments vegetals fermentats.

[eng] The enzyme diamine oxidase (DAO) is responsible for the intestinal degradation of histamine, acting as a physiological barrier against its entry into systemic circulation. A deficiency in DAO activity is considered the main cause of histamine intolerance. At present, treatment of this condition relies primarily on adherence to a low-histamine diet, although oral supplementation with exogenous DAO has emerged as a promising therapeutic strategy to promote intestinal histamine breakdown and improve the quality of life of affected individuals because they can follow a less restrictive diet. In 2017, the European Commission authorized the use of porcine kidney DAO as a novel food and ingredient for food supplements designed for the dietary management of histamine intolerance symptoms. The discovery of this enzyme in sprouts of certain plant species has opened the possibility of identifying new sources of DAO enzyme. The main objective of this doctoral thesis is to advance current knowledge of existing DAO sources, identify new ones, and develop innovative applications to manage histamine intolerance and limit the accumulation of histamine and other biogenic amines in fermented foods. Initial research focused on optimizing the enzymatic activity of the porcine kidney protein extract, we demonstrated that incorporating a preliminary lyophilization step for the raw material doubled the DAO activity of the extract. In addition, temperature control during drying and the application of specific biocidal treatments were identified as critical factors for maximizing enzymatic activity. Regarding storage conditions, refrigeration of the active ingredient preserved DAO activity for at least 24 months. Screening of various plant species revealed that sprouts from legumes, particularly chickpea, lentil, soybean, and green pea, possessed the highest DAO activity. The effect of several agrotechnological parameters on DAO activity and seed germination was then evaluated. Disinfection with sodium hypochlorite (70 mg/L, 15 minutes) significantly improved germination rates without compromising enzyme activity. The optimal binomial time-temperature was key to ensure maximum activity. Conversely, salt stress was counterproductive, reducing germination rate without boosting activity. For long-term storage, only freezing effectively preserved the DAO activity of lyophilized legume sprouts for at least 12 months. A comparative kinetic analysis of DAO enzymes from animal, plant, and microbial sources revealed significant functional differences. Although microbial DAO (from Yarrowia lipolytica) exhibited the highest specific activity, it had a much lower affinity for histamine than its animal and plant counterparts. Notably, DAO from legume sprouts was the only variant that did not show substrate inhibition. Under simulated intestinal conditions, plant DAO also demonstrated superior stability, with a half-life of 60 minutes compared with 20-30 minutes for the animal and microbial origin. Given the growing popularity of fermented plant-based foods, we also investigated the incorporation of a DAO-active ingredient derived from legume sprouts as an innovative approach to control the accumulation of biogenic amines in such products. The addition of lyophilized green pea sprouts to sauerkraut fermented under controlled laboratory conditions significantly reduced concentrations of putrescine, cadaverine, histamine, and tyramine. This deamination effect was consistently observed even in a complex food matrix containing all four amines simultaneously, simulating a more realistic scenario. Overall, the findings of this doctoral thesis demonstrate that both animal and plant sources are suitable for DAO production, with broad potential for application in dietary supplements for the management of histamine intolerance. However, DAO derived from legume sprouts offers distinct advantages: it is suitable for a wider population, can be produced more sustainably, and adds value to legume crops. Moreover, the use of this natural DAO-active ingredient represents a promising and innovative strategy to control amine content in fermented plant-based foods, thus improving their safety and quality.