Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

URI permanent per a aquesta col·leccióhttps://hdl.handle.net/2445/36275

Estadístiques

Examinar

Mostrant 1 - 20 de 115

Application of genomic tools to increase peach breeding efficiency
(Universitat de Barcelona, 2024-02-26) Zaracho Echagüe, Nathalia Helena; Eduardo Muñoz, Iban; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[eng] The peach tree ( Prunus persica ) is one of the most important fruit tree species worldwide, being the third most cultivated after apple and pear. Thus, it is one of the genetically best characterized species in the Rosaceae family. However, its low genetic variability poses a challenge for genetic improvement. Nevertheless, it is sexually compatible with other species in the Prunus genus, which allows for enriching the genome with new genetic variability that will help to cope with the new challenges imposed by climate change or new pests and diseases. To address these challenges, implementing innovative strategies that harness the intrinsic variability in the species to introduce new genes from wild or closely related cultivars is essential. These objectives stand as the central core of this thesis. In the first chapter, we investigated the inheritance of various fruit quality traits in an F2 population consisting of 418 individuals derived from the Sweet Dream variety. In this population, we identified QTLs for traits such as fruit weight (FW), fruit soluble solid content (SSC), fruit type (G, nectarine or peach), and the empirically phenotyped fruit aroma and taste. More specifically, we observed a relationship that suggests a pleiotropic effect of fruit type with FW and SSC. As per the fruit color traits, we focused on flesh anthocyanin patterns (RDF and CAS). For RDF, we identified a new QTL in G5, while for CAS we reported a different location of the Cs gene. In the second chapter, we implemented the Marker Assisted Introgression (MAI) strategy to introduce new genetic variability from Prunus davidiana into the peach genetic background. We used the elite variety 'Nectatop' as the recurrent parent and two interspecific hybrids ('Cadaman' and 'Barrier'), commonly used as rootstocks, as donor parents. We conducted a QTL analysis for various agronomic traits of interest in two BC 1 populations generated with each of the donor parents to investigate if any of the desired traits originated from P. davidiana . The most relevant traits for improvement included a new powdery mildew resistance gene, the Vr4 gene, and the detection of QTLs controlling green skin color in peaches and pulp bitterness. The resistance gene Vr4 was validated in a BC 2 population derived from 'Barrier', with 1 to 3 introgressions or P. davidiana in the peach genetic background. A collection of pre introgression Lines (PrILs) was selected from this population. Finally, in the third chapter, we studied the effects of drought by implementing two irrigation regimes using the PeachRefpop, the first multi site collection of peach varieties and cultivars. We evaluated phenology and tree vigor traits, showing a significant effect of the irrigation regime on most of these traits. Only FT and MD showed no difference between irrigation regimes. We were also able to compare two phenotyping methods for the Crop Water Stress Index (CWSI) through thermal imaging. Both manual measurements and a UAV platform were compared, concluding that, for phenotyping a population of this size, the methodology of the remote sensing technology (UAV) is the most accurate, reduces the impact of human error during measurements and is less time consuming.
Structural and functional analysis of natural protein-based inhibitors and their protease targets
(Universitat de Barcelona, 2022-10-28) dos Reis Mendes, Soraia Inês; Gomis-Rüth, Xavier; Eckhard, Ulrich; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[eng] Several proteases and their antagonistic protein or peptide inhibitors sparked researchers’ interest due to their potential as therapeutic targets. The present thesis, which compiles results obtained in three independent projects, unravels new information regarding protease and protease inhibitor structures and their mechanisms of action. In the first project, we assessed the involvement of human reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK) in embryogenesis and tumour suppression by investigating its involvement in the regulation of matrix metalloproteinases (MMPs). We developed bacterial and eukaryotic expression systems for the production of RECK variants and established an exhaustive purification protocol. The inhibitory activity of RECK variants towards MMP-2, MMP-7, MMP-9, and MMP-14 catalytic domain was assessed using fluorogenic peptides and natural protein substrates. Contrary to the published literature, no significant MMP inhibition was detected, suggesting that RECK is not a direct inhibitor of MMPs activity (Mendes et al., 2020). In the second project, we aimed to develop a specific and potent inhibitor of aureolysin, a protease and key virulence factor secreted by the human pathogen Staphylococcus aureus. The insect metallopeptidase inhibitor (IMPI) is a defensive molecule produced by the greater wax moth Galleria mellonella, which effectively and potently inhibits thermolysins from some pathogenic bacteria. In the thesis we evaluated IMPI inhibition of aureolysin activity in vitro and explored its mechanism of action through analysis of the crystallographic structure of the complex. Furthermore, in an attempt to obtain a more effective or specific aureolysin inhibitor, we designed a set of twelve mutants displaying single or multiple point mutations in the reactive-centre loop. The best aureolysin inhibition was achieved by the I57F mutant, with a calculated inhibition constant (Ki) of 346 nM. The work presented here provides extra input for the development of therapeutic proteins and peptide-based inhibitors based on IMPI and its inactivation mechanism for the treatment of infections caused by antibiotic resistant pathogens (Mendes et al., 2022). In the third project, a highly collaborative work was developed in order to explore the unique inhibitory mechanism of human plasma ⍺2M (h⍺2M), a homotetrameric protein of approximately 720 kDa, present in high concentrations in human plasma that performs several functions including the inhibition of peptidases. In this project we obtained eight ⍺2M structures by cryo electron microscopy (cryo-EM) elucidating the previously theoretical “Venus fly-trap” mechanism which allows the non- specific inactivation of up to two protease molecules independently of their catalytic type (Luque et al., 2022). Sparked by remarks during the review process of this paper, we then compared the function and biophysical properties of h⍺2M purified from fresh plasma with that of thawed frozen plasma through a range of experiments, providing light on this for the very first time, and demonstrating, that both h⍺2M preparations are indistinguishable (Mendes et al., in preparation).
Análisis etiológico de la enfermedad pudrición del cogollo (PC) en cultivo de palma aceitera (Elaeis guineensis Jacq.) en la provincia de Esmeraldas, Ecuador
(Universitat de Barcelona, 2022-03-24) Abel Valarezo, Vanessa Maribel; Grifoll Ruiz, Magdalena; Flores Flor, Francisco; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[spa] La palma aceitera (Elaeis guineensis Jacq.), a nivel mundial, es uno de los cultivos de aceite más importantes, uno de los de más alto rendimiento, y segundo más consumido. Una de las principales limitantes de la producción de palma es la enfermedad conocida como pudrición de cogollo (PC). En Ecuador se registró por primera vez en 1974, en la ciudad de Santo Domingo, luego de lo cual se extendió hacia las laderas amazónicas, generando un efecto devastador que resultó en la pérdida de un alto porcentaje de las palmas. Los cultivos de palma se localizan principalmente en la región costa, siendo la provincia de Esmeraldas la que concentra el 44.37% (109405 ha) de las 246574 ha plantadas y que presenta un mayor área de cultivos afectada por PC (82948 ha) de acuerdo al último censo palmero en 2017. El Centro de Investigación en Palma de Aceite (Cenipalma), en la búsqueda del agente causal de la PC en Colombia, identificó a Phytophthora palmivora en plantaciones de palma al norte de Colombia, sin embargo, en Ecuador no existen estudios que confirmen este hallazgo. En este trabajo de investigación se identifican los microorganismos potencialmente patógenos presentes en tejidos del primer y segundo estadio de PC de cultivos de palma aceitera del cantón Quinindé de la provincia de Esmeraldas. Para la identificación se emplearon técnicas dependientes de cultivo, barcoding y secuenciación de alto rendimiento (HTS). Se realizaron pruebas de patogenicidad con los microorganismos potencialmente patógenos. Adicionalmente, como posible tratamiento se valoró la actividad antagónica de agentes biológicos y químicos contra los microorganismos potencialmente patógenos. Finalmente se llevaron a cabo cuantificaciones de fenoles totales, como metabolitos implicados en la defensa y se evaluó la capacidad antioxidante de las palmas enfermas y sanas utilizando los métodos DPPH, FRAP y ABTS. En base a los resultados de HTS se determinó que los hongos más abundantes en plantas del primer estadio fueron Fusarium (20.73%) y Coprinopsis (16.75%), a diferencia del segundo estadio que fueron Antrodia (13.55%), un género no identificado de Didymellaceae (26.69%) y Candida (10.82%), mientras que en plantas sanas fue Kazachstania (81.81%). El género bacteriano más abundante en el primer estadio fue una bacteria perteneciente a la familia Enterobacteriaceae (17.13%), mientras que en el segundo estadio fueron Bacteroides (10.88%) y una bacteria perteneciente a la familia Enterobacteriaceae (7.08%). Con las técnicas dependientes de cultivo se obtuvo una mayor predominancia del género Fusarium en el primer estadio de la PC. Las pruebas de patogenicidad confirmaron la capacidad infectiva de las cepas E1H-35 (Fusarium oxysporum) y E1H-15 (Fusarium solani) al ser inoculadas en plantas sanas y producir lesiones cloróticas con necrosis similares a la PC. Se evidenció una mayor concentración de fenoles y poder reductor de los radicales FRAP, ABTS y DPPH, en los extractos metanólicos de las hojas de palma del primer estadio de PC y aparentemente sanas. De acuerdo a las pruebas antagónicas, la cepa E2H-3 (Trichoderma atroviride) y el fungicida Himexazol presentaron una mayor capacidad de inhibir los patógenos F. oxysporum y F. solani. La identificación de los microorganismos asociados a la enfermedad de PC en plantas de palma aceitera permitirá comprender la progresión etiológica de la enfermedad y que sirva como base para la búsqueda de un tratamiento.
Functional interplays of proteins and proteases: AD13-VWF, TGFβ2-α2M, and the proteolysis of gliadin by neprosin
(Universitat de Barcelona, 2021-06-11) Amo Maestro, Laura del; Gomis Rüth, Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[eng] The present thesis has established a new and state of the art mammalian protein expression system at the laboratory which has then contributed with high-yield expression for the purification and crystallization of three glycoproteins, namely TGFβ2, ADAMTS13 and Neprosin, which adopt important biomedical roles in human physiology, cardiovascular disorders, and celiac disease treatment, respectively. Proteases are major players in the physiology and pathology of all living organisms. Their often highly sophisticated regulation mechanisms are therefore essential for proper function, and to prevent misdirected spatial and/or temporal proteolytic activity, which in turn may trigger disease. This regulation is achieved through a wide variety of mechanisms including protein-protein interaction, substrate allosteric activation, or their biosynthesis as inactive precursor, so called zymogens. In the present thesis a variety of regulatory mechanisms of proteases and inhibitors were studied by using a combination of biochemical, biophysical and structural techniques. In the first project we comprehensively illuminate the biochemistry of the VWF:ADAMTS-13 axis. ADAMTS13 regulates the multimeric form of Von Willebrand Factor (VWF) in blood circulation by specific, shear-dependent proteolysis. Despite circulating in a seemingly latent form with a very long active plasma half-life, ADAMTS13 is resistant to plasma inhibitors and VWF is the only known substrate, and which involves an allosteric activation of ADAMTS13 by substrate binding. This unprecedented specificity has been attributed to extensive exosite interactions between the AD13-MDTCS domains, where the Disintegrin-like domain (D) approaches to Metalloprotease (M), Cysteine-rich (C), and Spacer (S) domain once the VWF is bound achieving a “tight” conformation. Structural analysis in solution revealed that the enzyme adopts a highly flexible unbound, latent structures and VWF peptide-bound, active structures that significantly differes from the AD13-MDTCS crystal structure. We integrate the experimental results with computational approaches. Thus, we hypothesize that the interaction culminates in a ‘fuzzy complex’ that follows a ‘dynamic zipper’ mechanism involving numerous reversible, weak but additive interactions that result in strong binding and ultimately in cleavage. In the second project a novel family of glutamate peptidases was studied and the crystal structure determined of both the active and zymogen form, establishing the active site, catalytic mechanism and protease class annotation, and describing a unique catalytic dyad composed by two glutamates while showing a close structural homology with eqolisins. Neprosin was recently discovered in the fluid of the carnivorous pitcher plant Nepenthes ventrata. Given its high activity at low pH, thermic stability and great specificity, neprosin is especially useful in detoxifying gluten proteins including wheat gliadin and the 33-mer immunogenic fragment into non-toxic peptides in a human stomach environment. Additionally, we determined its inhibitory profile against a cohort of peptidase inhibitors. Future approaches will study the effect of neprosin processing of the 33-mer on inflammatory responses in cells and tissue explants to elucidate if neprosin indeed presents an effective and harmless supplementation approach for gluten intolerant patients. In the third project the main protease inhibitor of the blood plasma has been studied; human α2 Macroglobulin (hα2Ms) has a great role on the human physiology by modulating the activity of cytokines such as TGFβ2. We characterised the interaction by a variety of biochemical, biophysical, and binding techniques. Intriguingly, during our crystallographic studies of the complex, we obtained a crystal structure of a TGFβ2 dimer in a novel dimeric assembly of biological unknown function. Overall, the present thesis contributes substantially to the field of structural biochemistry, expanding previous knowledge at the molecular level and adding new regulatory mechanisms, which will hopefully pave the way for the design of specific drugs for therapeutic interventions as well as lead to new approaches for treating coeliac disease through an enzyme supplementation strategy.
Participación del gen AtCPK1 en la defensa de Arabidopsis thaliana frente a patógenos
(Universitat de Barcelona, 2011-01-28) Orosa Puente, Beatriz; Coca, María; San Segundo, Blanca; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[spa] Las plantas han desarrollado mecanismos sofisticados de defensa para protegerse de los organismos perjudiciales de su entorno. La resistencia depende de múltiples mecanismos de protección que comprenden, tanto barreras físicas y químicas constitutivas, como respuestas inducibles. Estas son activadas ante el reconocimiento de la presencia del patógeno que desencadena en la planta una serie de reacciones defensivas que incluyen una reprogramación transcripcional de los genes de defensa, la producción de metabolitos secundarios (fitoalexinas), el reforzamiento de la pared celular y en algunos casos la muerte celular programada, con el fin de evitar la propagación del patógeno. Uno de los tópicos más importante de investigación en plantas y al cual se están dedicando grandes esfuerzos es entender los procesos de señalización que llevan a la activación de las respuestas de defensa en las plantas, por su particular relevancia en la protección de cultivos de todo del mundo. Las reacciones de defensa tempranas desencadenadas por la percepción del patógeno en las células vegetales comprenden la despolarización de la membrana plasmática, cambios en los niveles de calcio intracelular, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), seguidos por la activación de proteínas quinasas y los consiguientes procesos de fosforilación reversible de proteínas reguladas por calcio. Las plantas poseen diversas clases de proteínas sensoras de calcio, entre ellas las proteínas quinasas dependientes de calcio (CPKs o CDPKs). La peculiaridad de estas proteínas reside en que en la misma cadena polipeptídica encontramos el dominio quinasa, un dominio autorregulador y el dominio calmodulina de unión a Ca2+, pudiendo ser activadas directamente por la unión del Ca2+. Esta estructura tan particular de las CPKs las convierte en sensores de cambios en los niveles de calcio y transductores en actividad quinasa de proteínas que median los procesos de señalización posteriores. El trabajo de este proyecto de tesis doctoral ha estado dirigido al estudio y la caracterización de la participación de una proteína CPK de la planta modelo Arabidopsis thaliana, la proteína AtCPK1, en la defensa frente a patógenos. Al inicio del trabajo, se disponía de evidencias preliminares obtenidas en el grupo de investigación que demostraban la implicación funcional de esta proteína AtCPK1 en la resistencia de la planta a infección por patógenos, lo que justificaba el interés de este estudio. Los estudios desarrollados en este trabajo demuestran que la expresión del gen AtCPK1 se induce rápidamente en respuesta a la infección por el hongo patógeno Fusarium oxysporum y al tratamiento con elicitores derivados del mismo hongo en plantas de Arabidopsis. Además de la regulación transcripcional, se ha mostrado que la correspondiente proteína está regulada postraduccionalmente. Así, los niveles de acumulación de la proteína AtCPK1 están controlados por la vía de degradación de proteínas dependiente del proteasoma. También se ha observado que la proteína AtCPK1 presenta distintos estados de fosforilación, y en respuesta a la infección fúngica la proteína se fosforila bien por autofosforilación, bien por otras quinasas pendientes de indentificación. Por otra parte, la presencia de iones calcio determina de manera importante la capacidad de interacción de AtCPK1 con otras proteínas, mimetizando el efecto de la infección en relación a las proteínas que interaccionan con AtCPK1. Con el objetivo de entender mejor la participación de AtCPK1 en la respuesta de defensa de la planta y de identificar otros componentes implicados en las rutas de transducción de señales activadas por infección, en este trabajo se ha caracterizado el interactoma de AtCPK1 mediante diferentes estrategias complementarias. Entre las proteínas identificadas que interaccionan con AtCPK1 o asociadas a los complejos multiproteicos en los que participa AtCPK1 se encuentran proteínas de la familia de las 14-3-3, enzimas implicadas en la protección frente a estrés oxidativo (ascorbato peroxidasa y catalasas) y en la detoxificación celular (nitrilasas), así como también proteínas cloroplásticas que participan en el ciclo oxidativo del cloroplasto (la ATP sintasa y proteínas de unión a las clorofilas). Estos estudios además han mostrado una localización cloroplástica de la proteína AtCPK1, añadiendo un nivel de complejidad más en cuanto al compartimento subcelular en el cual AtCPK1 desempeña su función y se añade a las localizaciones anteriormente descritas para esta proteína en peroxisomas y cuerpos lipídicos de las células de Arabidopsis.
Prognostic markers and therapeutic targets for metastatic renal cell carcinoma
(Universitat de Barcelona, 2018-11-16) Bartrolí Comellas, Mariona; Casanovas i Casanovas, Oriol; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Fisiologia
[eng] Targeting cancer metastasis has gained considerable importance in the recent years when aiming to increase patients’ overall survival. In Renal Cell Carcinoma (RCC), the discovery of metastatic biomarkers and targets is still required, as most patients present metastatic disease at the time of diagnosis. Therefore, the aim of this thesis is the discovery of new biomarkers and targets of metastatic RCC using two variants of a patient-derived orthoxenograft (PDOX) animal model of clear cell RCC (ccRCC). Indeed, PDOX models have recently gained significant relevance for studying the progression of cancer and metastasis, due to their better mimicking of the histology, the metastatic capacity and treatment responses of human cancers. To this purpose, previous results had sequenced the two variants of this PDOX model, both at DNA and at RNA level, and had performed a FISH analysis. Firstly, Carboxypeptidase E (CPE), which was one of the highest expressed genes in the metastatic variant, has demonstrated to play a role in invasion when it is secreted to the medium, even though its overexpression alone is not sufficient to generate metastasis in vivo. In addition, it has showed a clear association to ccRCC and an inverse correlation with the overall survival of these patients. Secondly, we have studied two molecules of the coagulation pathway due to its relevance as one of the most upregulated pathways at RNA level. On the one hand, Factor XIII (FXIII or F13) has shown to be related to CPE in vivo, despite the overexpression of both molecules is not sufficient to develop all the metastatic cascade. However, it also affects the overall survival of ccRCC patients, highlighting these two molecules as possible biomarkers for this type of cancer. On the other hand, Coagulation Factor II Thrombin Receptor (F2R or PAR1) has demonstrated to play a role in metastasis, since its inhibition reduces both the early and late phases of this process. With the use of F2R inhibitors and the clinical association of the coagulation pathway to worse prognosis, this thesis opens new opportunities for the treatment of metastasis and cancer malignization. In summary, we have discovered new metastatic biomarkers and targets which, together with further validations, especially in the clinical setting, are proposed to be useful for RCC patients in the future.
Estudio de la proteína Gas6 y los receptores TAM como marcadores diagnósticos en patologías humanas
(Universitat de Barcelona, 2014-12-01) Recarte Pelz, Pedro; García de Frutos, Pablo; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[spa] La presente tesis estuvo orientada a analizar el posible papel que pudiera tener el sistema TAM en 3 enfermedades diferentes, y partiendo de la información obtenida, plantear el uso de estas proteínas como biomarcadores. Dicha idea surgió de la información existente sobre el sistema TAM en diferentes sistemas metabólicos, y del deseo de profundizar en los mismos. LUPUS: Con nuestro estudio quisimos analizar, por primera vez, los niveles de todos los miembros del sistema TAM en plasma. Evidenciamos una disminución tanto de la proteína S total, como de la libre en los pacientes con respecto a los controles, mientras que observamos un aumento de Gas6 en pacientes. También evidenciamos una correlación entre el aumento de Gas6 y la clasificación SLEDAI de los pacientes, lo que nos sugiere una evolución paralela de ambos parámetros. Estas observaciones nos llevaron a escoger a Gas6 como un posible candidato como indicador de progresión del Lupus. En el caso de los receptores solubles del sistema TAM, encontramos un aumento en todos ellos en pacientes en comparación con el grupo control, siendo el más relevante en sTyro3 y sAxl, y en menor medida en sMerTk. A nivel genético observamos una posible relación en cuento a tres polimorfismos de nucleótidos simples (SNP) y la concentración plasmática de sus productos. El caso más significativo fue el del Intron 1 de MERTK con la variante AA, asociado a un aumento de concentración superior al 100% en pacientes. Gracias a los resultados obtenidos podemos sugerir que el sistema TAM es un buen marcador de Lupus. INSUFICIENCIA CARDIACA: Es conocido que los miembros del sistema TAM se expresan en tejidos vasculares, por ello nos planteamos evaluar los niveles de expresión de Axl en pacientes de insuficiencia cardiaca, tanto a nivel de tejido como a nivel plasmático en su forma soluble (sAxl). Observamos mayores niveles del receptor en tejido de biopsias de miocardio de pacientes que en controles, alcanzando un promedio 6 veces superior. Esto nos sugiere una relación entre la proporción del receptor y la condición del órgano cardiaco. A nivel plasmático no solo detectamos mayores niveles de sAxl en pacientes que en controles, sino que además la concentración del receptor soluble se elevaba paralelamente al del deterioro de la condición del corazón de los pacientes. Estos datos nos dieron motivos para proponer a sAxl como un nuevo biomarcador de insuficiencia cardiaca. CÁNCER DE COLON: A partir de numerosos estudiados realizados en varios tipos de cáncer, sobre el papel del sistema TAM en los mismos, nos planteamos evaluar el efecto del mismo en muestras de pacientes de cáncer de colon. Evaluamos los niveles de expresión a nivel de mRNA de todos los componentes del sistema en tejidos pareados de pacientes. De esta manera pudimos evidenciar diferencias significativas en la expresión de Gas6, Tyro3 y MerTk, siendo menor en el último receptor. Sugerimos que los altos niveles de Tyro3 a nivel de mRNA, pueden contribuir a la aparición de cáncer, debido a su contribución en la supervivencia y migración de las células, factores fundamentales en el desarrollo del cáncer. Los niveles de este receptor en su forma soluble también fueron significativamente mayores en los pacientes en comparación con los controles sanos en las primeras etapas de cáncer, alcanzando el mayor grado de diferencia en el estadio IV de esta enfermedad. Con los resultados obtenidos de nuestro estudio podemos decir que el sistema TAM contribuye a crear las condiciones necesarias para la aparición de células cancerígenas o para el desarrollo y proliferación de las mismas.
Blood barriers for oncolytic adenovirus efficacy: study of binding to erythrocytes via CAR and albumin‐mediated evasion of neutralizing antibodies
(Universitat de Barcelona, 2017-05-26) Rojas Expósito, Luis Alfonso; Alemany Bonastre, Ramon; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[eng] Cancer virotherapy with oncolytic adenoviruses represents a promising therapeutic approach due to the capacity of these viruses to infect and selectively kill tumor cells without damaging normal tissues. Although the intravenous is the preferred route of administration in order to reach disseminated metastasis, several interactions with blood components cause the neutralization of the virus. Thus, improving the delivery of such adenoviruses to tumors by systemic injection is crucial for the success of the therapy. In this work we have studied the interaction of the adenovirus serotype 5 (Ad5) with human erythrocytes through the receptor CAR, which was described to sequester and inactivate the virus. Although erythrocyte binding was observed, it did not reduce viral transduction of tumor cells in vitro. Since mouse erythrocytes do not express CAR, human erythrocytes were transferred into nude mice to analyze the impact of erythrocyte binding after systemic administration. However, adenovirus extravasation and transduction of liver and tumors was not reduced, suggesting that this binding is reversible and does not neutralize the virus. On the other hand, the high prevalence of anti-Ad5 neutralizing antibodies (NAbs) is a major obstacle for the intravenous administration of adenoviruses. To protect adenovirus against NAbs we inserted an albumin-binding domain (ABD) in the main adenovirus capsid protein, the hexon. This domain binds serum albumin to shield the virus upon systemic administration. The ABD-modified adenoviruses bind human and mouse albumin, which allow them to maintain the infectivity and replication capacity in presence of NAbs. Non-modified adenoviruses are completely neutralized after systemic administration in pre-immune mice, whereas ABD-modified viruses preserve the ability to transduce target organs and induce oncolysis. The data presented in this thesis supports the use of this strategy to treat patients systemically with oncolytic adenoviruses. In summary, this thesis focused on improving the intravenous delivery of oncolytic adenoviruses, which is one of the main limitations of this therapy. The results presented in this work demonstrate that while erythrocyte binding via CAR does not inactivate the virus, NAbs represent a major obstacle for efficacy. In this regard, albumin coating of the virus capsid represents an effective approach to evade pre-existing NAbs. This strategy has translational relevance in the use of adenovirus by systemic injection not only for cancer virotherapy, but also for gene therapy and vaccination.
Arming oncolytic adenoviruses with bi-specific T-cell engagers to improve antitumor efficacy
(Universitat de Barcelona, 2017-05-19) Fajardo Calderón, Carlos Alberto; Alemany Bonastre, Ramon; Viñals Canals, Francesc; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[eng] Oncolytic adenoviruses that selectively replicate in cancer cells while sparing normal tissue have gained considerable attention as novel anticancer drugs. However, clinical trials with these viruses have identified the immune system as a major hurdle for their success in cancer patients. Despite the existence of a highly immunosuppressive tumor environment, adenovirus-infected cells can nonetheless be efficiently cleared by virus-specific infiltrating cytotoxic T lymphocytes without compromising tumor burden. We hypothesize that arming oncolytic adenoviruses with bi-specific T-cell engagers (BiTEs), a new class of antibodies that re-direct T-cells to cancer cells, might favor antitumor rather than anti-viral immune responses. We have engineered the oncolytic adenovirus ICOVIR-15K to express EGFR-targeting BiTEs under the control of the major late promoter. ICOVIR-15K armed with a BiTE targeting human CD3 and EGFR (ICOVIR-15K-cBiTE) was successfully rescued and it showed similar oncolytic properties as the parental virus. cBiTE expression and secretion was detected in supernatants from ICOVIR-15K-cBiTE-infected cells, and the secreted BiTEs bound specifically to both CD3+ and EGFR+ cells. In cell co-culture assays, ICOVIR-15K-cBiTE-mediated oncolysis resulted in robust T-cell activation, proliferation, and bystander cell-mediated cytotoxicity. Notably, intratumoral injection of this cBiTE-expressing adenovirus increased the persistence and accumulation of tumor-infiltrating T cells in vivo. Moreover, in two distinct tumor xenograft models, combined delivery of ICOVIR-15K-cBiTE with peripheral blood mononuclear cells or T cells enhanced the antitumor efficacy achieved by the parental counterpart. We also demonstrate that another oncolytic adenovirus expressing a chimeric BiTE targeting human EGFR and mouse CD3 (ICOVIR-15K-mcBiTE) induce robust mouse T-cell activation, proliferation, and cell-mediated cytotoxicity of cancer cells in vitro. Thus, ICOVIR-15K-mcBiTE is a promising surrogate of ICOVIR-15K-cBiTE that will aid in future pharmacological and toxicological preclinical studies of BiTE-armed oncolytic adenoviruses. Finally, we show that the combination of ICOVIR-15K-cBiTE with chimeric antigen receptor T-cell therapy can overcome some of the limitations encountered by both agents as monotherapies. The results described in this thesis demonstrate that BiTE-armed oncolytic adenoviruses hold properties with the potential of solving key limitations in oncolytic virotherapy, and encourage their further evaluation and development.
Functional study of the NIMA protein kinases Nek9, Nek6 and Nek7 at the onset of mitosis. Control of the kinesin Eg5 and prophase centrosome separation
(Universitat de Barcelona, 2016-09-13) Eibes González, Susana; Roig Amorós, Joan; Caelles Franch, Carme; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[eng] Mitosis is a tightly regulated process that aims to ensure the correct distribution of the chromosomes between the two newly generated cells. Many protein kinases have been defined as essential for this process: cyclin- dependent kinases, Aurora family and Polo family kinases are some of the most relevant players. The objective of this thesis is to characterize one of the less studied kinase pathways involved in this process, which is constituted by the NIMA-related kinases Nek9, Nek6 and Nek7. Nek9 is activated at the onset of mitosis by a double step mechanism mediated by CDK1 and Plk1. Once Nek9 is activated it can bind to Nek6 and Nek7 and phosphorylate them, promoting their activation. Finally, Nek6 and Nek7 are responsible for the phosphorylation of the kinesin Eg5, promoting Eg5 accumulation at centrosome, and consequently, centrosome separation. The kinesin eg5 motor protein is considered as one of the major players for centrosome separation and formation of the bipolar spindle. The tetramer configuration allows Eg5 to bind antiparallel microtubules and slide them apart, exerting a force that promotes centrosome separation and the maintenance of the bipolar spindle. Centrosome separation, however, is a highly intricate process that involves several pathways, including Eg5 activity. Dynein presents a directed activity towards the minus ends of microtubules, which has a redundant role to Eg5 in centrosome separation. Dynein accumulation at the cell cortex and the nuclear membrane, through its adaptor BicD2, is also involved in centrosome tethering at the nuclear envelope, a necessary step prior to separation. Furthermore, dynein can control the position of Eg5 at the spindle via TPX2, an event that could also happen before nuclear envelope breakdown (NEB). Here we describe the conditions required for Eg5 accumulation at the centrosmes after Ser1033 phosphorylation. During the development of this project we have explored the essential circumstances for correct Eg5 localization in cells. By using protein-protein interaction techniques and shRNA depletion of protein candidates we have determined that another motor protein, dynein, together with the adaptor BicD2 and the protein TPX2 are responsible for Eg5 accumulation around centrosomes. Additionally, we proposed TPX2 as a novel Nek9 substrate and we have investigated the role of this phosphorylation, which affects TPX2 localization during prophase, before NEB. We present with this thesis a model for Eg5 accumulation at microtubule minus ends and centrosome separation during prophase summarized in the following points: 1) Dynein complex transports Eg5 towards the centrosome. Dynein interacts with Eg5 independently of the Ser1033 phosphorylation. The adaptor BicD2, which interacts directly with Eg5 tail domain, mediates the interaction. Dynein motility towards microtubule minus ends and the presence of BicD2 on the complex are required for Eg5 localization at centrosomes. Thus, the dynein complex is required for Eg5 transport to the centrosomes during G2-M transition. 2) TPX2 inhibits Eg5 motility in response to Ser1033 phosphorylation. TPX2 is necessary for the correct localization of Eg5 at centrosomes during prophase. TPX2 mislocalization at centrosomes without altering its overall levels leads to failed Eg5 localization, therefore the presence of TPX2 at centrosomes during prophase is required for Eg5 localization. TPX2 interacts with Eg5 during mitosis and the interaction is abolished when the Ser1033 can’t be phosphorylated. Thus, TPX2 is able to respond to Eg5 Ser1033 phosphorylation, which we propose is promoting the interaction between these two proteins, and consequently inhibiting Eg5 motility at centrosomal levels. 3) TPX2 phosphorylation by Nek9 promotes its centrosomal localization. Nek9 phosphorylation of TPX2 is responsible for TPX2 localization at the spindle poles during prophase. Nek9 phosphorylates TPX2 at residues that are proximal to a NLS, making TPX2 localization more cytoplasmic and promoting its accumulation to the area where Nek9 is more active, the centrosome.
Identification and functional characterization of P1N-PISPO, a new gene product present in sweet potato potyviruses
(Universitat de Barcelona, 2016-05-31) Mingot Martí, Ares; López Moya, Juan José; Ferrer i Prats, Albert; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[eng] Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV) (Potyvirus genus, Potyviridae family) causes important yield losses in sweet potato crops, in particular in co-infections with the unrelated crinivirus Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV). This thesis addresses the characterization of some novel aspects in the infectious cycle of SPFMV, such as the expression, production and function of a new gene product named P1N-PISPO. A better understanding of SPFMV genome organization and the functions of their gene products might be relevant to improve the control strategies against this virus and the associated diseases in sweet potato crops. The positive-sense RNA genome of SPFMV contains a large ORF, translatable as a polyprotein yielding a set of functional mature gene products (P1, HCPro, P3, 6K1, CI, 6K2, VPg-Nla, Nlb and CP), and a short ORF named PIPO in the -1 frame, embedded within the P3 region. In addition to this organization, common to all the members of the Potyvirus genus, another ORF named PISPO was predicted in the genome. PISPO is in the -1 frame within the P1 region of SPFMV and other related potyviruses, starting at a conserved G1_2A6_7 motif, similar to the motif found upstream of PIPO. The expression of PISPO during SPFMV viral infection could result in the production of a putative new gene product P1N-PISPO. In the present work, the presence of the PISPO frame has been investigated in a Spanish isolate of SPFMV infecting Ipomoea batata plants. The genome sequence of this isolate has been assembled from NGS data, showing that the expected trans-framed PISPO sequences is present, preceded by a G2A6 motif. A specific analysis of the NGS data has revealed a significant proportion of transcripts with an extra A in the motif at the beginning of PISPO, as well as a lower proportion of transcripts with an extra in the corresponding conserved motif preceding the PIPO region. These results have demonstrated that a polymerase slippage mechanism could generate transcripts containing extra A residues (G2A7) to allow the translation of P1N-PISPO and P3N-PIPO gene products. Analysis of the viral gene products present in SPFMV infected plant tissues has been performed using LC-MS/MS after separation in SDS- PAGE, focusing in products > 50KDa. Peptides corresponding to the P1 protein have been detected from both the N-terminal portion (11 different peptides, 39% coverage), before the frameshifting signal and therefore common for P1 and P1N-PISPO, and in the C- terminal part (2 peptides exclusive for P1, 10% coverage). Interestingly, four peptides exclusive of PISPO, in its unique ORF (21.3% coverage), have been also found. These results have confirmed that both products P1 and P1N-PISPO are expressed and coexisted during SPFMV infection. Furthermore, transient expression of SPFMV gene products coagroinfiltrated with a reporter gene in Nicotiana benthamiana have revealed that P1N-PISPO acts as an RNA silencing suppressor, a role normally associated with HCPro in other potyviruses. Moreover, mutation of WG/GW motifs present in P1N-PISPO abolished its silencing suppression activity, suggesting that the function might require interaction with Argonaute components of the silencing machinery, as was shown for other viral suppressors. Altogether, the results of this thesis have confirmed the expression of P1N-PISPO during SPFMV infection and they have revealed a polymerase slippage mechanism as the responsible of P1N-PISPO production. Our results also have demonstrated the role of P1N-PISPO as a RNA silencing suppressor.
Identificación y caracterización de genes regulados por NOR-1 (Neuron-derived Orphan Receptor-1): implicación en el remodelado vascular y la diferenciación celular
(Universitat de Barcelona, 2016-04-29) Ferrán Pérez, Beatriz; Martínez González, José; Rodríguez Sinovas, Ma. Cristina; Laguna Egea, Juan Carlos; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[spa] Las enfermedades cardiovasculares constituyen la primera causa de muerte a nivel mundial. El común denominador de las enfermedades cardiovasculares de componente isquémico es la aterosclerosis. La complicación trombótica de las placas ateroscleróticas puede ocasionar eventos clínicos como el infarto agudo de micardio o los accidentes cerebrovasculares. En la evolución de esta patología juegan un papel clave las células musculares lisas de la pared vascular, que experimentan cambios importantes en su fenotipo y en su patrón de expresión génica. En la regulación de dichos cambios participa la familia de receptores nucleares NR4A. Los receptores NR4A (NOR-1, Nurr1 y Nur77) están codificados por genes de respuesta temprana, cuya expresión se induce por estímulos mitogénicos, pro-inflamatorios y pro-aterogénicos. Nuestro grupo identificó a NOR-1 (NR4A3) como un factor de transcripción implicado en la cardiopatía isquémica y en la migración, la proliferación y la supervivencia de las células vasculares. Actualmente se desconoce la identidad de la mayoría de los genes diana de NOR-1. Los objetivos principales de este proyecto fueron la identificación de genes regulados por NOR-1 a nivel vascular y la caracterización de los mecanismos moleculares por los cuales este receptor regula su expresión. En estudios de expresión génica diferencial en células musculares lisas que sobre-expresaban los receptores NR4A, identificamos un conjunto de genes cuya expresión se modulaba significativamente. Mediante diferentes estrategias confirmamos a MYOM1, A2M y SMPX como potenciales genes diana de NOR-1. MYOM1 codifica para la miomesina 1, una proteína implicada en la contracción de las fibras musculares. La alfa-2 macroglobulina (A2M) es una anti-proteinasa de amplio espectro presente en el plasma de los vertebrados. La regulación de A2M tiene lugar mediante la unión de los receptores NR4A a un elemento NBRE presente en su promotor. Los receptores NR4A modulan la actividad de las metaloproteinasas MMP-2 y MMP-9 a través de diferentes mecanismos, entre ellos mediante la inducción de la expresión de A2M. Además evidenciamos que la A2M se expresa de forma relevante en las células musculares de la capa media de las arterias humanas. Por su parte, el gen SMPX (Small Muscle Protein X-linked) codifica para una proteína asociada al citoesqueleto que se expresa sobre todo en células de músculo esquelético y cardíaco. La regulación de SMPX por NOR-1 se produce a través de un elemento NBRE no canónico. La diferenciación de mioblastos humanos de músculo esquelético (HSMM) a miotubos incrementa la expresión y los niveles de SMPX de forma dependiente de NOR-1. El silenciamiento de NOR-1, pero no el de SMPX, inhibe el proceso de diferenciación de las células HSMM.
Síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario: Estudio in vitro de variantes BRCA1 y BRCA2 de significado biológico desconocido y búsqueda de nuevos genes responsables de este síndrome
(Universitat de Barcelona, 2016-02-05) Quiles Vidal, Francisco de Asís; Lázaro García, Conxi; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
ANTECEDENTES: Entre un 20-25% de pacientes con cáncer de mama y ovario muestran historia familiar de dicha enfermedad. Una porción de estos casos son debidos a mutaciones germinales en genes de predisposición conocidos y se engloban dentro del síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario (SCMOH). Mutaciones en los genes BRCA1/2, genes de alta penetrancia para este síndrome, explican alrededor de un 20% de los casos familiares. El estudio mutacional de estos genes identifica entre un 2-15 de variantes cuyo significado biológico es desconocido (VSD), dependiendo de la población analizada y la casuística del laboratorio que las reporta. Debido a la imposibilidad de determinar el riesgo asociado a una VSD, éstas no pueden ser utilizadas como valor predictivo en el diagnóstico genético y dificultan el seguimiento clínico del portador. Por ello, la clasificación de estas variantes en patogénicas o neutras es de gran importancia desde del punto de vista del consejo genético. Además de lo mutaciones en los genes BRCA1/2, otras mutaciones de alta, moderada o baja penetrancia se han identificado en otros genes y con ellas se ha podido explicar una pequeña porción de los casos restantes del SCMOH. Muchos de estos genes han están involucrados en la vía de reparación de DNA de Anemia de Fanconi (FA)/BRCA, o son interactores de BRCA1/2. Si bien, más de un 50% de los casos familiares permanecen sin causa genética conocida. Estos casos son comúnmente conocidos como casos BRCAX. En este contexto, el uso de las nuevas técnicas de secuenciación de exomas ha demostrado ser una buena estrategia para la identificación de nuevos genes de predisposición al SCMOH. OBJETIVO: El objetivo global de esta tesis doctoral es mejorar el diagnóstico y el consejo genético de los pacientes con SCMOH mediante la clasificación de VSD en los genes BRCA1/2 y la búsqueda de nuevos genes de predisposición a este síndrome. RESULTADOS: Cuarenta VSD en BRCA1/2 fueron analizadas siguiendo diferentes aproximaciones experimentales. Veintiocho de ellas fueran analizadas a nivel transcripcional y 6 (4 en BRCA1 y 2 en BRCA2) fueron clasificadas como probablemente patogénicas en base a su efecto en el correcto splicing de estos genes. Otras 7 variantes, localizadas en la región C-terminal de BRCA1, fueron analizadas mediante el ensayo de actividad transcripcional. Tres de estas variantes pudieron ser clasificadas como probablemente patogénicas. Posteriormente, una de estas variantes, G1770V fué identificada por nuestro grupo como la primera mutación fundadora de origen Marroquí. Las cinco restante, situadas en BRCA2, fueron analizadas mediante el ensayo funcional basado en células embrionarias de ratón. Todas ellas mostraron un efecto hipomórfico y fueron asociadas a un riesgo bajo/moderado a sufrir cáncer d mama y/o ovario. En cuanto a la búsqueda de nuevos genes de predisposición al SCMOH se utilizaron dos aproximaciones para su identificación. Por un lado, se secuenciaron dos genes nuevos genes de la vía de FA/BRCA, los genes ERCC4 y SLX4, en un set de pacientes BRCAX. Este estudio identificó varias variantes missense nuevas en cada gen. Varias de ellas fueron clasificadas como potencialmente deletéreas por varios programas de predicción in silico. No obstante, la validación funcional de estas variantes es necesaria para elucidar su asociación con el SCMOH. Como segunda aproximación, se secuenció el exoma de varios pacientes pertenecientes a familias BRCAX con un aparente patrón de herencia autosómico dominante. Como resultado, se identificaron 20 genes potencialmente candidatos para ser genes de predisposición al SCMOH. Entre ellos, POLE destaca como firme candidato. CONCLUSIÓN: Este trabajo, en su conjunto, contribuye a la mejora del diagnóstico y consejo genético mediantes la identificación de nuevas variantes de predisposición en al SMCOH en los genes BRCA1/2 y la identificación de nuevos genes candidatos al SCMOH
Correction of point mutations at the endogenous locus of the mammalian dihydrofolate reductase gene using polypurine reverse hoogsteen hairpins
(Universitat de Barcelona, 2016-03-04) Solé Ferré, Anna; Ciudad i Gómez, Carlos Julián; Noé Mata, Verónica; Universitat de Barcelona. Departament d'Àlgebra i Geometria
[cat] Aquest treball es centra en l'estudi de pinces de polipurines "polypurine reverse Hoogsteen (PPRH)", i la seva capacitat com eina en la correcció de gens. La reparació d'una mutació puntual en el seu locus endogen ha sigut el principal tema de molts investigadors en les últimes dècades, utilitzant diverses estratègies com per exemple la teràpia de substitució de gens (GAT) i diferents oligonucleòtids de reparació. La fibrosi quística, anèmia de cèl.lules falciformes i la malaltia de Tay-Sachs son alguns exemples de la gran quantitat de trastorns causats per una mutació puntual. En aquest treball, presentem una metodologia de reparació alternativa que utilitza molècules PPRH, desenvolupades en el nostre laboratori inicialment com a eina de silenciament gènic, amb la hipòtesi que també es podrien aplicar com a eina de correcció de gens. Els PPRH son unes molècules d'ADN de doble cadena, formades per dos dominis de homopurines antiparal•eles, connectades per un bucle de 5 timidines, que formen enllaços de Hoogsteen reversos i intramoleculars. Els PPRHs s'han descrit per unir-se eficaçment a la doble cadena d'ADN formant una estructura de tríplex, i han sigut dissenyats tant contra la cadena motlle com contra la cadena codificant de l'ADN. Tenint en compte la capacitat dels PPRHs per formar una estructura de tríplex amb la cadena de pirimidines de l'ADN, en l'estudi presentat aquí volíem explorar la capacitat dels PPRHs per corregir mutacions puntuals. En primer lloc, es van estudiar les condicions in vitro en les que els PPRHs s'unien a la doble cadena de l'ADN i la mantenien oberta, mitjançant assajos d'unió. Tot seguit, hem dissenyat diferents PPRHs reparadors, tot afegint, al nucli del PPRH, una cua reparadora, complementaria a la regió mutada de l'ADN excepte pel nucleòtid que ha de ser corregit. Aquests PPRHs reparadors s'han utilitzat en cèl.lules de mamífer per reparar una mutació puntual en un plàsmid de la dihydrofolate reductasa (dhfr). Per últim, els resultats positius ens van portar a estudiar la capacitat dels PPRHs reparadors per reparar diferents línies cel.lulars que contenien diferents tipus de mutacions puntuals en el gen endogen de la dhfr. A més, també hem desenvolupat un PPRH millorat, anomenat LDR-PPRH, per "Long-Distance-Repair-PPRH", per reparar mutacions puntuals molt distants respecte la seqüència diana del nucli del PPRH. Tenint en compte la possible alta proporció de guanines en una seqüència de PPRH, es va dur a terme una caracterització in vitro d'aquestes molècules per estudiar l'efecte de les guanines en la formació d'estructures secundàries, com per exemple els G-quàdruplex. També es va estudiar la conformació de triple hèlix formada pels PPRH reparadors amb les seves seqüències diana de pirimidines, fins i tot quan el PPRH reparador es plega en una estructura de G-quàdruplex enlloc de en forma de pinça. Com a segona part de la tesi, hem desenvolupat una nova aplicació de la tècnica d'assaig de canvi de mobilitat electroforètica (EMSA), per demostrar la unció entre els miRNAs i les seves seqüències diana. Durant més de dues dècades, la investigació en el nostre laboratori s'ha centrat en l'estudi farmacogenòmic de la resistència al metotrexat (MTX) en la quimioteràpia contra el càncer, per la inhibició del gen de la dhfr. A més de l'amplificació gènica, el nostre grup ha demostrat que molts gens estan involucrats en el mecanisme, així com també hi estan involucrats els micro-RNAs. El miR-224 i els seus gens diana, SLC4A4, CDS2 i HSPC159 van ser identificats per jugar un paper important en la resistència al MTX en cèl.lules de càncer de colon. Per aquesta raó, el miR-224 va ser l'escollit per mostrar d'una manera directa i específica, la seva habilitat per unir-se al gen diana SLC4A4, establint així la tècnica d'EMSA com un mètode senzill i útil per validar la interacció entre un miRNA i la seva diana específica de mRNA.
Caracterització de la proteïna LICC1 amb els dominis LisH-CTLH-CRA de blat de moro
(Universitat de Barcelona, 2015-11-23) Miquel Jaureguibeitia, Mercè; Vicient Sánchez, Carlos M.; Arró i Plans, Montserrat; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[cat] En aquesta Tesi s'han estudiat tres gens a partir d'una llibreria de cDNA d'embrions de blat de moro de 10 DAP. Els tres cDNAs escollits van ser: MKA5, que codifica un pèptid antimicrobià de la família CYCLOTIDE; MMH3, que codifica una proteïna de la família de MAP65 associades a microtúbuls, i MIH1, que codifica la proteïna LICC1 involucrada en diferents processos biològics. La proteïna LICC1 conté els dominis LisH, CTLH i CRA. La funció del domini LisH és la d'interactuar amb els microtúbuls i altres proteïnes. Les funcions dels dominis CTLH i CRA sembla ser la d'interactuar amb d'altres proteïnes. Un estudi filogenètic mostra que LICC1 és homòleg a les proteïnes GID8 i TWA1 de llevat i mamífers, respectivament, que formen part del complex proteic GID/MRCTLH. Aquest complex sembla que participa en múltiples funcions cel•lulars, entre les que es troba la degradació de certes proteïnes via ubiquitinació. E1 gen liccl s'expressa més o menys a tots els teixits i la seva proteïna s'acumula també a molts teixits, tot i que presenta diferents formes probablement degudes a modificacions post-traduccionals. S'ha demostrat mitjançant la centrifugació diferencial que LICC1 està associada a complexos d'alt pes molecular. Experiments de cosedimentació demostren que LICC1 interactua amb els microtúbuls i experiments in vivo amb plantes i cèl•lules transformades de tabac i d'Arabidopsis amb fusions de LICC1 a YFP demostren que LICC1 colocalitza amb les tubulines com a mínim en certs teixits i condicions ambientals. Tractaments amb drogues que afecten als microtúbuls produeixen variacions en la localització de LICC1. La part de LICC1 responsable de la interacció amb els microtúbuls es la que conté els dominis LisH i CTLH. Davant d'un estrès hídric LICC1 passa a estar localitzat als cossos lipídics sent el domini CRA la part responsable de l'interacció amb proteïnes. En vaquestes condicions l'acumulació de LICC1-YFP s'incrementa a les cèl•lules de guarda dels estomes. A més a més, la sobreexpressió de LICC1-YFP produeix una reducció en el creixement però un increment en la resistència a l'estrès hídric. Experiments d'immunoprecipitació han demostrat que LICC1 es capaç també d'interactuar amb una polifenol oxidasa. Amb aquests resultats suggereix que LICC1 formaria part del complex GID/MRCTLH i participaria en múltiples funcions. Aquest complex podria associar-se als cossos lipídics en condicions d'estrès, a on podria actuar com scaffold i interactuar amb d'altres proteïnes, per exemple, promovent la seva ubiquitinació. Una d'elles podria ser la PPO detectada.
Polypurine Reverse Hoogsteen hairpins: stability, lack of immunogenicity and gene silencing in cancer therapy
(Universitat de Barcelona, 2015-12-22) Villalobos Alberú, Xenia; Ciudad i Gómez, Carlos Julián; Noé Mata, Verónica; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[spa] Este trabajo se centra en el estudio de la estabilidad y potencial inmunogénico de las moléculas llamadas PPRHs (Polypurine Reverse Hoogsteen hairpins), y en su uso como herramienta de silenciamiento génico. Los PPRHs son moléculas de DNA no modificadas. Están formadas por dos cadenas antiparalelas de polipurinas unidas por un bucle pentatimidínico, lo que permite la formación intramolecular de enlaces de Hoogsteen reversos entre ambas cadenas. Anteriormente se demostró que los PPRH son capaces de unirse a una secuencia de dsDNA mediante enlaces de Watson-Crick, formando un triplex que desplaza la cadena polipurínica de la diana. La prueba de principio para el uso de los PPRH como agente terapéuticos se llevó a cabo con un PPRH dirigido al gen de la survivina el cual fue validado tanto in vitro como in vivo. En esta tesis se ha profundizado en el conocimiento de los PPRHs. Se ha establecido que estas moléculas son estables en diferentes tipos de suero, así como intracelularmente. Además se determinó que los PPRHs, no inducen la activación de la respuesta inmune innata, ya que su transfección a una línea monocítica no incrementó los niveles de expresión de los factores de transcripción IRF3 y NF-κB, y tampoco de las citoquinas proinflamatorias IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IL-1β, y IL-18. Además, los PPRHs no indujeron la activación del inflamasoma. También se diseñaron dos estructuras nuevas de PPRH: PPRH circulares y PPRHs basados en RNA, y se estudiaron diversos parámetros como su capacidad de unión a la diana y su citotoxicidad. Para ampliar la aplicabilidad de estas moléculas, se validó el uso de los PPRHs sobre diversos genes relevantes en cáncer: BCL2, MDM2, MYC, TOP1 y MTOR. Esta validación se realizó en diversas líneas tumorales (PC3, MIA PaCa-2, HCT116, SKBR3, MCF7 y MDA-MB-468) observando que los PPRHs fueron capaces de disminuir la supervivencia de las células y la expresión de los genes diana, y de aumentar la apoptosis. Finalmente, se realizó una aproximación para incrementar la especificidad de los PPRHs, la cual incluye el uso de un aptámero de DNA dirigido a la proteína de membrana HER2.
Regulació posttraduccional de l’alanina aminotransferasa mitjançant mecanismes d’interacció proteïna-proteïna
(Universitat de Barcelona, 2016-02-02) Giralt, Marina; Vázquez Baanante, Ma. Isabel; Metón Teijeiro, Isidoro; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[cat] Una de les principals fites en aqüicultura és aconseguir una reducció de les proteïnes que se subministren amb la dieta, procedents majoritàriament de farines de peix, i incrementar la presència de nutrients més rendibles, com ara els carbohidrats. En tractar-se principalment d'espècies carnívores, la substitució de proteïnes per carbohidrats està limitada per les característiques metabòliques dels peixos en cultiu. L'activitat alanina aminotransferasa (ALT) hepàtica juga un paper central com a connexió entre el metabolisme d'aminoàcids i el de carbohidrats, i s'ha mostrat com l'aminotransferasa hepàtica més sensible a canvis en l'estat nutricional i la utilització de proteïna en moltes espècies de peixos. L'ALT pot estar implicada en múltiples processos cel.lulars i la seva activitat podria estar sotmesa a un sistema complex de regulació. El nostre grup va clonar tres isoenzims d'ALT a partir de fetge de Sparus aurata, indicant l'existència de dues isoformes citosòliques, cALT1 i cALT2, i una isoforma mitocondrial mALT, de diferent distribució tissular i regulació nutricional. Donat que les modificacions posttraduccionals a què pot estar sotmesa l'ALT són poc conegudes, es va voler estudiar si existeixen proteïnes capaces d'interaccionar i modular l'activitat de les isoformes citosòliques d'ALT. Mitjançant un assaig de doble híbrid en llevat s'ha identificat els fragments de quatre proteïnes amb potencialitat d'interacció amb cALT2, que corresponen a l'F-lectina, RPS20, RBP2 i HABP2. F-lectina és una proteïna d'unió a carbohidrats present en peixos i amfibis, que presenta un pèptid senyal de secreció. Estudis de localització subcel•lular indiquen que, tot i que cALT1 i cALT2 són preferentment citosòliques, quan s'expressen conjuntament amb l'F-lectina, les proteïnes passen a formar vesícules perinuclears de gran mida que colocalitzen amb marcadors de cis-Golgi, trans-Golgi i vesícules de secreció. Aquest fet suggereix que les proteïnes cALT1 i cALT2 són incorporades a la via de secreció a través de la interacció amb F-lectina. Els anàlisis de FRET validen la interacció entre cALT1 o cALT2 i F-lectina. En cèl.lules transfectades amb plasmidis d'expressió de cALT1, cALT2 i F-lectina, la presència d'F-lectina augmenta l'activitat ALT en els extractes on s'expressa cALT1 o cALT2, suggerint que l'F-lectina és capaç de modular l'activitat d'ALT. F-lectina s'expressa majoritàriament en fetge, ronyó i teixit adipo& teixits on també s'expressen cALT1 i cALT2. En orades injectades intraperitonealment amb lipopolisacàrid (LPS) 1mg/kg de peix, 24 hores després del tractaments'observa un increment en l'expressió d'F-lectina, i un augment en l'activitat ALT en extractes hepàtics, sense observar canvis en els nivells d'mRNA de cap de les isoformes ALT. L'augment de l'activitat ALT és degut, hipotèticament, a un augment en l'expressió d'F-lectina, que a la seva vegada provoca un augment en l'activitat de l'enzim ALT a través de la interacció de l'F-lectina amb cALT1 i cALT2. Addicionalment, s'ha observat que la incubació de cultius bacterians E. coli amb extractes cel.lulars on se sobreexpressen les proteïnes cALT2, F-lectina i cALT2 conjuntament amb F-lectina, produeix una inhibició del creixement bacterià. Aquesta efecte antibacterià es podria donar pel fet que cALT2 conté una regió homòloga a la regió d'unió a endotoxines de la proteïna LBP, responsable de la unió i presentació de I'LPS a altres proteïnes del sistema immunitari. Els nostres estudis suggereixen que a més del seu paper metabòlic, les isoformes citosòliques d’ALT poden estar implicades en processos del sistema immunitari en orada.
Mechanisms of proteolytic activity regulation exerted via a unique propeptide in matrix metalloproteinases and intra/intermolecular interactions in a novel family of minimal gluzincins
(Universitat de Barcelona, 2015-11-13) López Pelegrín, Maria del Mar; Gomis Rüth, F. Xavier; López Arolas, Joan; Badía Palacín, Josefa; Universitat de Barcelona. Departament d'Àlgebra i Geometria
Les metal·lopeptidases participen de manera decisiva en la fisiologia i patologia de tots els organismes vius. La seva estricta regulació és, per tant, essencial pel correcte funcionament d’aquestes i per a prevenir una activitat proteolítica inadequada en el temps i/o espai que podria causar malalties. Aquesta regulació s’aconsegueix mitjançant un ampli ventall de mecanismes, incloent la seva biosíntesis com a precursors inactius, també coneguts com a zimògens. En la present tesi s’han estudiat diversos mecanismes de regulació de metal·lopeptidases, tot combinant tècniques bioquímiques, biofísiques i estructurals. En el primer projecte, l’estructura cristal·lina d’un fragment zimogènic de la proteïna “karilysin” de Tannerella forsythia ha revelat el propèptid més curt descrit fins al moment per una metal·lopeptidasa. Assajos bioquímics i biofísics addicionals han permès determinar la importància del propèptid en l’expressió, plegament i estabilitat de la proteïna. En el segon projecte, s’ha descobert una nova família de metal·lopeptidases mínimes d’origen procariota, que s’han anomenat “minigluzincins”, les quals proporcionen un model estructural per a metal·lopeptidases pertanyents al clan de les gluzincines i per a d’altres integrals de membrana. Dues membres d’aquesta família, anomenades “proabylysin” i “projannalysin”, han exhibit formes úniques de manteniment de latència exercides, respectivament, de forma intra- i intermolecular mitjançant llurs segments C-terminals. En el tercer projecte, una altra membre d’aquesta nova família, anomenada “selecase”, ha presentat una activitat proteolítica selectiva i específica sobre caseïna. La conjunció d’estudis duts a terme, tant biofísics com estructurals, ha evidenciat que “selecase” transita de manera reversible entre diverses conformacions d’estructura tridimensional definida, associades amb una disminució d’activitat enzimàtica deguda a autoinhibició (és a dir, monòmers actius i dímers, tetràmers i octàmers inactius). En definitiva, aquesta tesi contribueix de manera substancial a ampliar el coneixement previ sobre metal·lopeptidases a nivell molecular i a entendre els mecanismes que en regulen l’activitat, facilitant així el disseny d’inhibidors específics com a part d’aproximacions terapèutiques.
Análisis transcriptómico y de microarrays para la identificación de genes biomarcadores de la utilización de los nutrientes de la dieta en músculo esquelético de dorada (Sparus aurata)
(Universitat de Barcelona, 2015-10-30) Sáez Arteaga, Alberto Felipe; Vázquez Baanante, Ma. Isabel; Metón Teijeiro, Isidoro
[spa] La acuicultura constituye una de las actividades productivas de mayor desarrollo en las últimas décadas. Entre los peces de origen marino, la dorada (Sparus aurata) es la especie de mayor producción en España y en Europa. Sin embargo, a pesar del interés en la producción, los recursos genómicos para estudiar el impacto de los nutrientes de la dieta en el metabolismo son limitados. Actualmente, el análisis de expresión génica a nivel de mRNA es una de las principales herramientas utilizadas en estudios de genómica funcional. En este sentido, el estudio del transcriptoma mediante tecnologías de pirosecuenciación de última generación y el desarrollo de microarrays, que determinan perfiles de expresión de decenas de miles de genes, representan un avance para los estudios de la funcionalidad génica. El objetivo de esta tesis doctoral fue realizar un análisis transcriptómico del músculo esquelético de dorada con aplicación para estudios nutricionales, e identificar mediante microarrays, genes biomarcadores de la utilización de nutrientes. Cinco grupos de doradas fueron alimentadas durante 23 días con dietas de diferente composición: HPLLLC, MPHLLC, LPLLHC, MPLLHC, LPHLLC (letras mayúsculas representan niveles de nutrientes [High, Medium and Low], letras en superíndice representan el tipo de nutriente [Protein, Lipid and Carbohydrate]). Adicionalmente, durante un periodo similar, un grupo de doradas se mantuvo en ayuno. Se llevaron a cabo dos diseños experimentales: el experimento 1 fue diseñado para estudiar el transcriptoma del músculo esquelético de dorada y el experimento 2 tuvo como finalidad estudiar el aprovechamiento de los nutrientes de la dieta y el efecto de la composición sobre la digestibilidad, ingesta, parámetros somáticos y metabolismo intermediario. El análisis transcriptómico realizado con RNA de músculo esquelético de doradas, permitió obtener 691433 secuencias de alta calidad, correspondientes a 275,9 megabases. 4799 anotaciones fueron asignadas a categorías de ontología génica (GO). El análisis GO mostró que los procesos biológicos más representados correspondieron a oxidación-reducción, ciclo celular y división celular. Las funciones moleculares más abundantes fueron: unión a proteínas, unión a nucleótidos y actividad transferasa. La información transcriptómica se utilizó para analizar, mediante RT-qPCR, el efecto del estado nutricional sobre la expresión de genes relacionados con la cadena de transporte electrónico, fosforilación oxidativa y translocación de ATP al espacio intermembrana. De los genes analizados, la expresión de citocromo C oxidasa subunidad 5B y la caja de unión a ATP subfamilia G mostró una fuerte dependencia de la composición de la dieta, incrementando la expresión de dichos genes en peces alimentados con la dieta de menor contenido proteico y mayor contenido de carbohidratos. La información transcriptómica se utilizó, asimismo, para estudiar el efecto del estado nutricional y la composición de la dieta sobre el patrón global de expresión en músculo mediante microarrays. El análisis GO indicó que el ayuno se asocia a expresión diferencial disminuida en genes con funciones moleculares de actividad antioxidante y de unión a proteínas. Al realizar la comparación entre peces alimentados con dietas de diferente composición, se observó que las dietas de alto/medio contenido en proteína y bajo contenido de carbohidratos promovieron un incremento en la expresión de genes implicados en funciones de crecimiento, regulación y organización del citoesqueleto. Adicionalmente, mediante RT-qPCR, se analizó la expresión de genes implicados en procesos como: regulación de la miogénesis, regulación del crecimiento y vía de señalización Akt/TOR. En esta tesis doctoral, podemos concluir que la expresión de citocromo C oxidasa subunidad 5B, caja de unión a ATP subfamilia G, GHRs y MyoD2 podrían resultar de utilidad en estudios biotecnológicos encaminados a optimizar la utilización de los nutrientes en las dietas de doradas en cultivo.
Regulació hormonal del metabolisme hepàtic del glicògen: efectes del glucagó, l'epinefrina i la insulina
(Universitat de Barcelona, 1978-10-01) Massagué i Solé, Joan, 1953-; Guinovart, Joan J. (Joan Josep), 1947-; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)
[cat] El mecanisme d’acció a nivell molecular de les hormones glucagó, epinefrina i insulina constitueix el centre d'interès al qual apunta el nostre treball. Un camí especialment adequat per aproximar-nos als fets desencadenats a la cèl.lula per l’arribada dels senyals hormonals esmentats és el que es basa en emprar com a testimonis d'aquests fets les vies de síntesi i degradació del glicogen, el carbohidrat de reserva als animals i a l'home. Ben justament, car: a) aquestes vies metabòliques són molt susceptibles a les accions hormonals, b) són comunes a la majoria dels teixits de mamífer, tot i que a cadascun d’aquests hi presenten característiques particulars, c) ocupen una posició clau dins del metabolisme energètic de l'organisme. A més, hem fixat l’atenció en el teixit hepàtic. Al fetge, òrgan que té un paper cabdal en l'administració de la reserva de carbohidrats de l’organisme, el mecanisme i les particularitats del control hormonal de les vies metabòliques del glicogen presenta encara molts punts obscurs. Els coneixements actuals sobre el tema estan ben allunyats de conclusions definitives. En el transcurs dels darrers vint anys treballs notabilíssims dins la Bioquímica han reeixit a mostrar bastant clarament quin és el mecanisme utilitzat per les hormones com l'epinefrina per forçar el catabolisme i la producció d’energia al teixit muscular. Ara bé, l'extrapolació gratuïta d'aquestes troballes per al cas del fetge és una operació extremadament perillosa. El glucagó i la pròpia epinefrina impulsen la glicogenolisi hepàtica. Per la temptació de simplificar hom podria atribuir a ambdues hormones un mecanisme d'acció al fetge igual al que opera al múscul esquelètic a mercè de l'epinefrina. Durant una bona colla d'anys recents no s'ha comptat amb cap evidència experimental séria contra aquesta suposició. Però certes troballes han anat suggerint grans diferències entre la manera de fer del glucagó i de l'epinefrina al fetge, i entre la manera com actua aquesta darrera hormona al teixit muscular o a l’hepàtic. D'altra banda també cal contemplar l'acció de la insulina. L'efectivitat del control del metabolisme hepàtic per aquesta hormona ha estat motiu de controvèrsia àmpliament debatut. A aquest fet hi han contribuït la dificultat per observar efectes directes de l'hormona sobre els elements cel.lulars i el desconeixement existent sobre els detalls del seu mecanisme d'acció el qual es revel.la complexíssim. Tal estat de coses ofereix una oportunitat àmplia per a treballar-hi. Per fer-ho hem escollit la tècnica que actualment permet la millor aproximació als esdeveniments desencadenats pels estímuls hormonals sobre el metabolisme hepàtic; ens referim a l'isolament i utilització corn a material d'estudi de cèl.lules del parènquima hepàtic de mamífer (rata) intactes estructural i funcionalment. Les dades obtingudes en el present estudi clarifiquen el mecanisme d'acció del glucagó, defineixen el caràcter dels efectes de l'epinefrina i recolzen fermament la possibilitat del control del metabolisme hepàtic del glicogen per la insulina

El Dipòsit Digital ha actualitzat el programari. Contacteu amb dipositdigital@ub.edu per informar de qualsevol incidència.

Examinar

Enviaments recents