Tesis Doctorals - Departament - Biologia, Sanitat i Medi Ambient
URI permanent per a aquesta col·leccióhttps://hdl.handle.net/2445/105625
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TesiOrigin, morphological, genetic, and chemical variability, and traditional uses of Cannabis: basis for new applications(Universitat de Barcelona, 2025-04-07) Balant, Manica; Garnatje i Roca, Teresa; Vitales Serrano, Daniel; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia, Sanitat i Medi Ambient[eng] Cannabis sativa L. (hereafter referred to as Cannabis) is one of the earliest domesticated plants, with human use spanning over millennia for a variety of purposes. Given its widespread use and significance, Cannabis has been the focus of research in diverse scientific areas, from medicine, pharmacy, and agronomy to environmental and social sciences. However, most of the research has concentrated on modern hemp cultivars and drug strains, with limited attention given to wild-growing populations or traditional landraces across the plant's natural distribution area, leaving significant gaps in understanding their diversity. Similarly, while numerous publications have documented the traditional uses of Cannabis, this body of knowledge remains fragmented across various types of literature. This fragmentation, much like the limited research on wild-growing populations, complicates efforts to conduct comprehensive statistical analyses and gain a holistic understanding of the plant's diversity and cultural significance. This doctoral thesis aims to fill this gap by exploring the genetic, morphological, and phytochemical diversity of Cannabis and its traditional uses worldwide through seven interconnected studies. The research integrated various interdisciplinary methods, such as flow cytometry, Hyb-Seq genomic analysis, high-resolution geometric morphometrics, phytochemical analysis using UPLC-MS, and systematic ethnobotanical data collection, offering a comprehensive view of this versatile plant. In the first chapter we explored the genetic and cytogenetic diversity of Cannabis. Using flow cytometry, we examined genome size diversity across a wide range of wild-growing, landrace, and cultivated Cannabis accessions. The analysis revealed minimal variation in ploidy levels, with only one triploid individual identified, while the rest were diploid. A 1.189-fold variation in genome size was observed, but no strong correlation was found between genome size and geographical distribution or between wild-growing and cultivated plants. This suggests that the geographical expansion and domestication of Cannabis had a limited effect on its genome size. Notably, significant differences in genome size were observed between male and female plants. In another work of this chapter, we examined the phylogeographic and population genetics structure of wild-growing and landrace Cannabis populations, by employing a Hyb-Seq approach, combining shotgun sequencing and target capture with the Angiosperms353 enrichment panel. The results supported the classification of Cannabis as a monotypic genus, structured into three primary genetic groups: E Asia, which is sister to both Paleotropis group and Boreal group. Further subdivisions within these groups revealed phylogeographic patterns driven more by geographical distribution than by use-type. In the second chapter we focused on the morphological diversity of Cannabis. Due to significant changes in leaflet number during the plants’ development, a novel method was developed that allows, for the first-time, the application of a high-resolution geometric morphometrics approach on the entire leaf. By using polynomial models across more than 3,000 pseudo-landmarks, we modelled theoretical leaves with comparable leaflet numbers. This innovative approach enables the accurate prediction of genetic and developmental traits, providing new insights into Cannabis leaf morphology and uncovering heterochronic mechanisms responsible for changes in leaf shape during the development. Phytochemical diversity was the focus of the third chapter, which analysed cannabinoid composition in different Cannabis tissues, sexes, and across different phylogeographic groups identified in the first chapter. Significant differences in cannabinoid profiles were found between male and female inflorescences, but not between the leaves of either sex. While the cannabinoid profiles did not precisely correlate with phylogeographic groups, there was a clear differentiation between cultivated drug-type landraces and wild-growing populations, indicating the influence of selective breeding during domestication. The last, forth chapter explored traditional knowledge of Cannabis use. The first study in this chapter involved the development of the CANNUSE database, which consolidated 2,330 entries from 649 publications across 41 countries, providing a valuable resource for understanding traditional Cannabis uses. The second study analysed the standardized dataset from CANNUSE database and found that medicinal applications dominated, treating over 200 human ailments. Strong associations were observed between specific Cannabis plant parts and their corresponding uses and in treating different body systems. The third ethnobotanical study investigated the traditional knowledge of Cannabis use in Armenia through ethnobotanical surveys and bibliographic review. The results revealed a significant decline in medicinal and fibre uses but highlighted the continued importance of Cannabis seeds in alimentary uses, particularly in symbolic dishes, demonstrating the persistence of Cannabis as an important cultural and historical resource. In conclusion, the results of this thesis highlight the extraordinary genetic, morphological, and phytochemical diversity of Cannabis, particularly evident when focusing on wild-growing populations and traditional landraces. The findings support the classification of Cannabis as a monotypic genus, with marked intraspecific variability. The newly gathered comprehensive dataset of traditional uses provided novel insights into its rich traditional heritage, and revealed new potential applications rooted in traditional knowledge. These results underscore the importance of further research and the preservation of diversity within wild-growing populations of this versatile species.- TesiEstudi etnobotànic de l’Alt Urgell(Universitat de Barcelona, 2024-09-17) Altimiras i Roset, Jacint; Vallès Xirau, Joan, 1959-; Garnatje i Roca, Teresa; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia, Sanitat i Medi Ambient[cat] La comarca de l’Alt Urgell situada el nord-oest del Principat de Catalunya, és la segona comarca més extensa de Catalunya amb 1.447,5 km2 i una població de 20.762 habitants a l’any 2023. La seva capital és la Seu d’Urgell. Aquesta tesi doctoral consisteix en un estudi etnobotànic d’aquesta comarca del Pirineu català. El domini lingüístic català ha estat força ben prospectat des del punt de vista de l’etnobotànica, disciplina que estudia la relació entre societats humanes i plantes, i, en particular, l’àrea pirinenca, però la comarca indicada encara no havia sigut investigada, per la qual cosa hem volgut cobrir aquest buit de coneixement. El mètode utilitzat ha sigut bàsicament l’entrevista etnobotànica semiestructurada, amb observació participant i amb consentiment informat previ. Les persones informants han estat localitzades pel mètode de bola de neu. Els testimonis de les plantes indicades per elles han estat dipositats a l’herbari BCN, del Centre de Documentació de Biodiversitat Vegetal de la Universitat de Barcelona i se n’han dipositat molts duplicats a l’herbari BC, de l’Institut Botànic de Barcelona. Entre els anys 2009 i 2023, s’ha entrevistat 445 informants, 227 dones i 218 homes, d’entre 13 i 96 anys (mitjana 70,82), de 146 nuclis de població dels 19 municipis de la comarca, sobre el coneixement i la utilització de plantes. S’ha obtingut informació sobre 688 tàxons pertanyents a 113 famílies botàniques. L’índex d’etnobotanicitat és de 31,1 %, la qual cosa indica que, aproximadament, un terç de la flora del territori és conegut, nomenat i usat per les persones informants. Les persones informants han reportat 2.587 fitònims (incloent-hi variants fonètiques) per a aquests tàxons així com informació sobre usos medicinals de 352 tàxons (86 famílies), alimentaris de 296 tàxons (68 famílies) i d’altra mena de 1.451 tàxons (76 famílies). A més, han estat recollides 385 barreges de plantes per a ús medicinal i 81 barreges de plantes per a ús alimentari. Amb aquestes dades, s’ha elaborat els catàlegs etnoflorístics de l’Alt Urgell, un de tàxons i dos de barreges, un per a cadascuna de les modalitats esmentades. Cal assenyalar també l’aplegada de 14 plantes que, per manca de material, no han pogut ser determinades, així com de 62 fongs (incloent-hi un liquen; amb 147 micònims) i quatre algues (amb dos ficònims); aquests materials no formen part dels catàlegs abans esmentats. De manera general, les famílies botàniques més reportades són les compostes (93 tàxons; 13,52%), papilionàcies (61 tàxons; 8,87%), labiades (42 tàxons; 6,10%), gramínies (36 tàxons; 5,23%) i rosàcies (32 tàxons; 4,65%). El factor de consens d’informants és 0,93, la qual cosa indica una alta coherència de les dades i dona força als resultats obtinguts. Els resultats indiquen, al territori estudiat i malgrat l’erosió del coneixement popular sobre la natura que es dona en tota societat industrialitzada, un saber tradicional sobre la biodiversitat vegetal molt elevat i que ara, un cop inventariat, serà preservat per a les generacions futures.
- TesiEstudi etnobotànic i revitalització dels recursos vegetals del delta del Llobregat(Universitat de Barcelona, 2024-07-19) Marín Fernandez, Juan Manuel; Vallès Xirau, Joan, 1959-; Garnatje i Roca, Teresa; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia, Sanitat i Medi Ambient[cat] La plana dreta del delta del riu Llobregat (Catalunya) és un territori complex i molt antropitzat. És pràcticament impossible trobar cap lloc en aquest espai periurbà on la petjada humana no es faci evident. No obstant això, dins d'aquest territori hi ha ecosistemes com el Parc Natural del Delta del Llobregat i el Parc Agrari del Baix Llobregat, que aporten riquesa i rellevància en termes de diversitat vegetal. Aquesta tesi doctoral es divideix en tres seccions, que comparteixen l'objectiu comú d'estudiar la diversitat vegetal i els coneixements ecològics locals associats per a impulsar la revitalització del territori i els seus recursos a través de pràctiques de disseny. La primera secció consisteix en un inventari etnobotànic de la plana dreta del delta del riu Llobregat, mitjançant un estudi etnoflorístic complet, que inclou els diferents usos i noms de les plantes conegudes, apreciades i utilitzades pels humans. La segona secció es centra en l'anàlisi de la biodiversitat agrícola comercialitzada al Parc Agrari del Baix Llobregat, a través de l'inventari exhaustiu dels productes agrícoles venuts en diferents centres de distribució, especialment als mercats de pagès, establint relacions amb la biodiversitat agrícola cultivada i el coneixement botànic tradicional del mateix territori. La tercera secció té com a objectiu establir relacions entre l'etnobotànica i el disseny per tal de preservar i millorar els recursos vegetals del territori mitjançant eines d'innovació i revitalització. La metodologia utilitzada es basa, entre altres eines, en l’ús d'entrevistes semiestructurades amb informants locals, sobretot en la primera i en la segona secció. Per a la tercera secció, s'han utilitzat eines específiques de la disciplina del disseny. S'ha documentat un gran nombre de coneixements tradicionals associats a espècies vegetals existents, pertanyents a una àmplia varietat d'usos, especialment relacionats amb l'alimentació, la medicina i uns usos artístics endogens del territori estudiat. Aquesta tesi inclou el catàleg etnobotànic de l'àrea d'estudi. D'altra banda, s'ha posat de manifest la importància dels circuits de distribució curts per preservar i promoure la biodiversitat agrícola local, i, com a tercer punt, s'han mostrat les possibilitats del disseny com a estratègia per revitalitzar i reivindicar la diversitat vegetal. La conclusió a la qual s'ha arribat és que hi ha una diversitat vegetal rellevant en aquesta zona periurbana de gran tensió territorial, així com interessants coneixements etnobotànics associats, però són necessàries eines i estratègies multisectorials per preservar i revitalitzar aquest ric patrimoni natural i cultural.
- TesiEstudio multidisciplinar de la helmintofauna parásita de Arvicola scherman, Microtus lusitanicus y Talpa occidentalis(Universitat de Barcelona, 2024-05-15) Adalid Villaronga, Roser; Miquel Colomé, Jordi; Fuentes i Ferrer, Màrius Vicent; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia, Sanitat i Medi Ambient[spa] Se realiza un estudio multidisciplinar relacionado con los helmintos parásitos de Arvicola scherman, Microtus lusitanicus y Talpa occidentalis, procedentes de diferentes localidades de Asturias (España). Este estudio consiste en el análisis de faunísitico y ecológico de las comunidades de helmintos hallados en cada especie hospedadora, el estudio ecotoxicológico del binomio T. occidentalis / Ityogonimus spp. y el estudio ultraestructural del espermatozoide de Ityogonimus ocreatus. Se analizaron un total de 815 ejemplares de A. scherman, hallándose un total de 6 especies de helmintos, 1 cestodo y 5 nematodos. Las especies fueron Hydatigera taeniaeformis larvae, Aonchotheca wioletti, Eucoleus bacillatus, Trichuris arvicolae, Carolinensis minutus y Syphacia nigeriana. De todas ellas, únicamente las 4 especies más prevalentes (H. taeniaeformis larvae, T. arvicolae, C. minutus y S. nigeriana) se consideraron para el estudio ecológico. Las prevalencias, los valores de la riqueza de especies y los índices de diversidad calculados fueron bajos. Los factores analizados para el estudio ecológico fueron la edad y el sexo del hospedador y la estación y año de captura. Hydatigera taeniaeformis larvae, T. arvicolae y C. minutus únicamente se vieron influenciadas por la edad del hospedador, mientras que S. nigeriana lo estuvo por la edad del hospedador y por el año y la estación de captura. Los ejemplares analizados de M. lusitanicus fueron 710 y se hallaron 8 especies de helmintos parásitos, 4 cestodos (larva cisticercoide, H. taeniaeformis larvae, Paranoplocephala omphalodes y Kontrimavichusia asymmetrica) y 4 nematodos (T. arvicolae, C. minutus, Heligmosomum costellatum y S. nigeriana). Las prevalencias de las especies halladas, así como los valores de riqueza de especies y los índices de diversidad calculados fueron bajos. Se analizaron los mismos factores que en M. lusitanicus para el estudio ecológico con las especies más prevalentes (H. taeniformis larvae, T. arvicolae, C. minutus, H. costellatum y S. nigeriana). Hydatigera taeniaeformis larvae y T. arvicolae se vieron influenciadas por la edad del hospedador, C. minutus por la edad del hospedador y por el año y estación de captura y S. nigeriana por la estación y año de captura. De T. occidentalis se analizaron 104 ejemplares, hallándose un total de 10 especies: 2 trematodos (Ityogonimus lorum e Ityogonimus ocreatus), 6 nematodos (Capillaria talpae, Liniscus incrasatus, Trichuris feliui, Tricholinstowia sp., Spirura talpae y Porrocaecum sp. larvae) y 2 acantocéfalos (Monliliformis sp. y Plagiorhynchus sp. larvae). Las prevalencias obtenidas, así como los valores de riqueza de especies y los índices de diversidad fueron bajos. Para el estudio ecológico se analizaron los mismos factores que en los hospedadores anteriores con las especies más prevalentes (Ityogonimus spp., C. talpae y L. incrasatus). No se hallaron influencias de estos factores sobre las especies. El estudio ecotoxicológico consistió en analizar las concentraciones de 3 metales pesados: mercurio, plomo y cadmio en muestras de tejidos de T. occidentalis y de sus parásitos Ityogonimus spp. Los tejidos analizados del hospedador fueron hígado y riñón de ejemplares parasitados y no parasitados por estos digénidos. No se detectaron diferencias significativas entre las concentraciones de estos metales entre las diferentes muestras. Los valores de bioconcentración indican que este binomio es un buen modelo como bioindicador de contaminación por mercurio y plomo. El espermatozoide de I. ocreatus está formado por 2 axonemas desiguales con la estructura típica 9+’1’ de los platelmintos Trepaxonemata, 2 haces de microtúbulos corticales, con un número máximo de 45 microtúbulos, una mitocondria filiforme, ornamentación externa asociada a microtúbulos corticales, cuerpos espinosos y el núcleo. Además, presenta gránulos de glucógeno. La secuencia de desaparición de caracteres hacia el extremo posterior es la siguiente: primer axonema, mitocondria, microtúbulos corticales, núcleo y segundo axonema.
- TesiBenthic marine algae from South Shetland Islands (Antarctica): biodiversity and evolutionary patterns(Universitat de Barcelona, 2021-09-17) Martín Martín, Rafael Pablo; Gómez Garreta, Ma. Amelia; Rull, Jordi; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia, Sanitat i Medi Ambient[eng] The present work focuses on different aspects related to the Antarctic seaweed. As the main primary producers of the coastal areas of Antarctica, this group of organisms play a key role in shaping the biological communities and the ecological dynamics of Antarctic shores. However, compared to other groups of Antarctic organisms or the seaweed communities of other regions of the world, Antarctic macroalgae remain less studied. This is especially true in several areas of knowledge as their actual biodiversity, their evolutionary history and patterns, some aspects of their ecology or the total extent of their relations with other Antarctic organisms and their environment. Aiming to address the lack of knowledge of these areas, we aimed to extend it by focusing our work in several key aspects of Antarctic seaweed biology. As so, we tried to respond several specific questions regarding the topics above mentioned. In this context, we studied biodiversity of seaweed communities that are present in the South Shetland Islands. For that, we tried to identify the composition and influencing factors of the seaweed assemblages present in Deception Island. We also studied how seaweed biodiversity affects Antarctic epiphytic diatoms richness, studying the composition of them, both from Deception and Livingston islands. Moreover, we tried to expand the data with evolutionary relevance by analysing the nuclear DNA content and ploidy levels (C values), as well as the nuclear developmental patterning of some common Antarctic seaweed species with no previous data for those characters. This was achieved by using a fluorimetry technique that sets a reference for comparison for future studies on those parameters. Additionally, we condensed the latest knowledge on the chemical ecology of seaweeds and other organisms from Antarctica, and tried to expand it by investigating the potential antimicrobial activity of these seaweeds. For this, we tested their natural extracts against several Antarctic microorganisms and identified several species that were active chemically. Also, we tested the same extracts for antimicrobial action against several microorganisms that are common human pathogenic surrogates and identified potential human interest in these seaweeds on the search for new sources of antibiotics. Finally, we reported our findings on the role seaweed have in the context of climate change in the Antarctic region. Those findings include the identification of non-native kelp rafts that arrived to the maritime Antarctica, and presented several passenger species that have potential invasiveness in the Antarctic. Regarding that, we classified and explored the possible roles that the rafts themselves and the species travelling with them may play in futures scenarios of climate change in Antarctica.
- TesiDetection of Helicobacter pylori Microevolution and Multiple Infection, and Genomic Analysis of Helicobacter pylori Strains(Universitat de Barcelona, 2019-11-29) Palau de Miguel, Montserrat; Miñana i Galbis, David; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia, Sanitat i Medi Ambient[eng] In the past decades, Helicobacter pylori has received the attention of many researchers because of its known relation with gastric cancer. Although many studies have tried to decipher the exact relation between the bacteria and cancer state, and several virulence factors have been discovered, an exact answer has not been found yet. Further work should be made in order to study more accurately the genome of this bacterium and to understand its precise involvement. The bacterium is characterised for a highly genetic diversity, meaning it is continuously changing in order to adapt itself to its hostile niche, the human stomach. Infection by H. pylori is estimated to affect half of the world’s population, being more extended in developing countries than in developed ones, possibly due to the high consumption of antibiotics and the increased level of sanitation in the latest. It has been demonstrated that the gastric lumen can be colonized by more than just one strain of the bacterium, sometimes these strains could have evolved from the same ‘mother’ strain, or they could come from unrelated strains. The study of these situations is important in order to elucidate if there is just one strain who is responsible for starting the pathogenic cascade, and what are the specific differences between the different strains that inhabit the human stomach. On the first work of this thesis, our group studied the usefulness of six housekeeping genes for the detection of H. pylori infection and the characterization of various strains isolated from gastric isolates, studying as well their phylogeny. In some cases, the distance value between the strains was high, indicating and event of multiple infection. In other cases, small differences were found between clones, suggesting events of microevolution rather than multiple infection. This work was further extended with the study of the usefulness of amplicon sequencing of these housekeeping genes in the detection of microevolution and mixed infections from gastric biopsies of patients with dyspeptic symptoms and different histopathological findings (from atrophy to adenocarcinoma). Five gastric biopsies from four patients infected by H. pylori were involved in this study. We detected in all the analyzed gastric biopsies multiple H. pylori infections with a predominant strain. These results suggest that H. pylori colonizes the human stomach through diverse infection circumstances that lead to a gastric multi-infection with a predominant strain together alongside other minority strains. Furthermore, it was shown that mixed infections are the main status in the colonization of the human gastric mucosa. The last part of this thesis started with a preliminary study of 51 complete sequenced H. pylori genomes and further focused on three genomes obtained from the same patient in order to analyse and compare them. Particularly, these isolates were sampled at the same time from a stomach with adenocarcinoma, one strain was from the non- tumoral tissue, and the other two were isolated from the tumoral tissue. They all lacked from the most noticeable virulence factor, the cag pathogenicity island; one of the most studied and the main factor related to the malignancy of the bacterium. On the other hand, we found differences in the genotype of the vacuolating cytotoxin gene (vacA) and in genes related with urease, the outer membrane and flagella. Despite the contributions made in this thesis, further studies are needed to find better genetic markers of H. pylori related to virulence and progression to gastric cancer.
- TesiNuevos tensioactivos catiónicos basados en ramnolípidos y aminoácidos: propiedades fisicoquímicas y biológicas(Universitat de Barcelona, 2019-11-22) da Silva, Anderson Ramos; Manresa Presas, Ma. Ángeles (María Ángeles); Pérez Muñoz, Lourdes; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia, Sanitat i Medi Ambient[spa] La búsqueda de nuevos productos que sean multifuncionales, biocompatibles, biodegradables y que puedan alcanzar los objetivos económicos y ambientales establecidos en la actualidad se ha convertido en una cuestión no solo importante, sino que también esencial. Los avances recientes en la ciencia y la tecnología han otorgado a los biotensioactivos un papel más visible y predominante debido a que provienen de rutas de producción renovables basadas en microbios. De todas las variedades de microorganismos que producen estas sustancias, las especies del género Pseudomonas producen un tipo de glicolípidos típicamente llamados ramnolípidos (RLs). Recientemente, se están aplicando enfoques innovadores para mejorar la multifuncionalidad de estos ramnolípidos. El objetivo principal de esta memoria de tesis fue la modificación estructural de RLs convencionales para la obtención de RLs con carga positiva con el fin de conseguir nuevas moléculas que posean diferentes propiedades fisicoquímicas y biológicas de cara a ampliar el campo de aplicación de los precursores. Los resultados obtenidos indicaron que estos tensioactivos tienen la capacidad de formar agregados vesiculares a bajas concentraciones de estudio y son muy efectivos en reducir la tensión superficial del agua necesitando para ello poca cantidad de producto. Además, se observó que todos los tensioactivos obtenidos en este trabajo son fácilmente biodegradables en condiciones restrictivas, dando a entender que en el medio ambiente se degradarían con mayor facilidad. En esta memoria también se demostró que los nuevos ramnolípidos catiónicos derivados de arginina no solo presentan una actividad antimicrobiana a bajas concentraciones frente a los tres microorganismos representativos: bacterias, levaduras y protozoos, sino que también se observó que estos derivados consiguen desestructurar biofilms maduros de Candida spp. resistentes al fluconazol. Todos los ramnolípidos estudiados mostraron tener actividad antitumoral frente a líneas tumorales de mama, cuello uterino y piel. En general, son tensioactivos que presentan moderada citotoxicidad y actividad hemolítica. Se demostró que los ramnolípidos catiónicos derivados de lisina y arginina tienen la capacidad de compactar el ADN a bajas concentraciones y podrían ser estudiados como una alternativa futura para su aplicabilidad en el campo de la terapia génica. Como conclusión general, la combinación de un grupo de cabeza con carga positiva (aminoácidos) acoplada a los ramnolípidos (monoRL y Rlmezcla) permitieron la obtención de nuevos compuestos multifuncionales, de bajo coste económico, biocompatibles y biodegradables.
- TesiCharacterization of the enzymes involved in the diolsynthase pathway in Pseudomonas aeruginosa(Universitat de Barcelona, 2019-07-12) Shoja Chaghervand, Shirin; Manresa Presas, Ma. Ángeles (María Ángeles); Busquets Abió, Montserrat; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia, Sanitat i Medi Ambient[eng] In 2015 our research group described, in P. aeruginosa, the oleate-diol synthase system which consists of two sequentially and independently enzymatic reactions: 10S-Dioxygenase (10-DOX) (PA2077) used oleic acid (as preferred substrate) and converted into hydroperoxide 10-H(P)OME ((10S)-hydroxy(per)oxi-(8E)- octadecenoic acid), followed by the bioconversion of the hydroperoxide into 7,10- DiHOME ((7S, 10S)-dihydroxy-(8E)-octadecenoic acid) by an 7,10-diol synthase (7,10-DS) (PA2078). This products, synthetized in the periplasm, are specifically exported though ExFadLO outer-membrane transport to the extracellular medium, where they accumulated and act as bioactive compounds. Finally a new single operon is responsible for this diol synthase activity that contains two genes PA2077 and PA2078 contiguously located in the genome. In this study we characterized recombinant 10S-DOX and 7,10-DS enzymes, expressed by E. coli and demonstrated that other proteobacteria have ability to produce oxylipins. Also we have shown that E. coli DH5α/pMMB-77 and E. coli BL21/pET28a-78 can express aggregate proteins as inclusion bodies under stress conditions with catalytic activity consist of the corresponding enzymes. As accessing to commercial 10-H(P)OME is not available, for the first time produced 10-H(P)OME from P. putida (pBBR-77) by 10S-DOX during 1 h of incubation time in the presence of oleic acid as substrate at 30 ºC. Biochemical characterization of soluble 10S-DOX and 7,10-DS have shown, maximum enzyme activity for 10S-DOX was at 30 ºC and for 7,10-DS at 35 ºC. Also, results indicated the thermal stability of 7,10-DS was slightly higher than of 10S- DOX, but both enzymes losing most of their activates at 50 ºC (only remained 20% of activity). Activity of 10S-DOX and 7,10-DS in different range of pH 7-10 show activity of both of them increasing between this range of pH. The effect divalent metal ions (1 mM) on 10S-DOX and 7,10-DS was assayed. The activity of 7,10-DS increased in the presence of Mg2+, Cd2+, and Ni2+ while the activity of 10S-DOX was decreased in the presence of same metal ions. After inducing recombinant E. coli DH5α/pMMB-77 and E. coli BL21/pET28a-78 by IPTG, insoluble IBs were obtained to purification and refolding. Study of functional activity of purified IBs have shown in both cases enzymes were trapped in IBs-77 and IBs-78 with activity. Structure and morphology of IBs were characterized by different techniques. Transmission electron microscopy (TEM), demonstrated size and morphology of IBs. Images have shown IBs-77 and IBs-78 appears as dark and dense region inside cells that it seems IBs-78 are denser than IBs-77. Infrared spectrometry (FTIR) and dye binding with Congo red (CR) and Thioflavin T (ThT) were used to reveal the amyloid structure of IBs. In both cases, the spectra obtained from FTIR displayed amyloid aggregate which consist of β-sheet structure. Also dye binding demonstrated presence of amyloid structure in IBs-77 and IBs-78. Atomic force microscopy (AFM) provide direct images of IBs before and after digestion with Proteinase K that were observed purified IBs-77 collapse about 61- 65% after digestion and 70-84% in the case of IBs-78. In order to assess whether the diol synthase system is a common occurrence among bacteria, an experimental screening of other proteobacteria demonstrated that some of the species belong to the genera Aeromonas, Pseudoalteromonas, Shewanella, Thauera, Ensifer and Pseudomonas were able to produce 10S-H(P)OME and 7,10- DiHOME from OA as substrate, which are the same products obtained from P. aeruginosa diol synthase pathway.
- TesiMyeloid p38 MAPK signaling in intestinal homeostasis, inflammation and tumorigenesis = Señalización por la MAPK p38 de células mieloides en la homeostasis, inflamación y tumorogénesis intestinal(Universitat de Barcelona, 2017-10-27) Youssif, Catrin; Rodríguez Nebreda, Ángel; Comalada Vila, Mònica; Universitat de Barcelona. Departament de Biomedicina[eng] Chronic inflammation is a hallmark of colon cancer, and patients with inflammatory bowel disease are prone to developing colon tumors. In recent years, many efforts have been devoted to characterize the interplay between inflammation, the tumor microenvironment and tumorigenesis. However, the molecular and cellular events involved in the pathogenesis of colitis-associated carcinogenesis are not fully understood. Myeloid cells play a key role in the tumor microenvironment, regulating tumor growth and therapeutic responses. One of the pathways that is often implicated in inflammatory diseases and cancer relies on the protein kinase p38. Specifically, p38 is a key regulator of epithelial cell homeostasis protecting against inflammation-associated colon tumorigenesis in mice. However, the contribution of myeloid p38 to colitis-associated tumorigenesis has been largely neglected. Therefore, the objective of this thesis is to investigate the role of myeloid p38 in intestinal mucosal repair and its implications in colorectal cancer by performing in vivo assays in mice. We further complemented the in vivo experiments using cellular models. We observed that mice with myeloid cell-specific downregulation of p38α generate less colon tumors in response to AOM/DSS treatment compared to wild-type mice. Our results extend previous findings indicating that myeloid p38 is a key mediator of inflammatory responses, and identify insulin-like growth factor-1 (IGF-1) as a novel effector downstream of p38 signaling in macrophages. To our knowledge, the regulation of IGF-1 by p38 in macrophages has not been described previously. IGF-1 is a natural growth hormone that is known to have also anti-inflammatory and pro-repair functions. We found that myeloid cells are a major source of IGF-1 in the large intestine, and genetic or pharmacological inhibition of IGF-1 suppresses inflammatory cell recruitment and reduces colitis-associated colon tumor burden. Ly6ChiCCR2+ monocytes are continuously generated in the bone marrow from hematopoietic stem cells and recruited to healthy and injured tissues, where they give rise to intestinal effector cells. Our studies demonstrate that Ly6ChiCCR2+ monocytes are reduced in p38-ΔMC mice and IGF-1-ΔMC mice compared to WT mice, even without any treatment. We believe this is important for the observed phenotype, given the key role of inflammatory monocytes in triggering the recruitment of other immune cells as well as in the initiation of the adaptive immune response. Our results indicate that suppression of p38 in myeloid cells ameliorates intestinal inflammation mainly through repression of inflammatory cell recruitment, which in turn results in reduced tumor burden. Several human and mouse studies have demonstrated that the regulation of inflammatory cytokines by p38 plays important roles in the pathogenesis of inflammatory diseases. In accordance, we observed that p38 in myeloid cells positively regulates key inflammatory mediators during intestinal inflammation. However, our results indicate that the decreased levels of inflammatory mediators and IGF-1 observed in DSS-treated p38-ΔMC mice correlates with a reduced number of infiltrated immune cells. Currently, the IGF-1 pathway is gaining tremendous interest due to its important role in cancer as well as inflammatory bowel disease, not only by modulating the innate and acquired immune system, but also through its multi-functional involvement in the tumor microenvironment. Our results suggest that targeted inhibition of the p38 pathway in myeloid cells could be therapeutically useful especially in tumors associated with chronic inflammation. Of note, IGF-1 is known to have mitogenic and anti-apoptotic functions, in addition to its role in inflammatory cell recruitment. Therefore, the targeting of extracellular effectors produced by myeloid cells that are implicated in disease pathogenesis such as IGF-1 might overcome the difficulty of targeting specific cell types.
- TesiUtilidad de diferentes técnicas serológicas y moleculares en el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad de Chagas y en la caracterización de Trypanosoma cruzi(Universitat de Barcelona, 2017-03-08) Abras Feliu, Alba; Gállego Culleré, M. (Montserrat); Muñoz Batet, Carme; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia, Sanitat i Medi Ambient[spa] Los movimientos migratorios han permitido la expansión de la enfermedad de Chagas a zonas no endémicas. Se dispone de una gran cantidad de pruebas para el diagnóstico de la enfermedad, la mayoría de ellas serológicas, pero su utilidad en diferentes grupos de población, fases de la infección y seguimiento de la enfermedad todavía no es bien conocida. Recientemente se han desarrollado técnicas de nueva generación que no han sido tenidas en cuenta en los protocolos existentes, los que implican el análisis de un gran número de muestras por varias pruebas serológicas, con costes elevados en el presupuesto de salud. Por otro lado, el diagnóstico serológico tiene el inconveniente de la elevada persistencia de los anticuerpos tipo inmunoglobulina G (IgG) en pacientes crónicos y la detección de IgG pasivas de origen materno en recién nacidos. La caracterización molecular de Trypanosoma cruzi en muestras de los pacientes busca identificar asociaciones entre las Unidades Discretas de Tipificación (UDTs) del parásito y el desarrollo clínico de la enfermedad. Existen diferentes marcadores moleculares, pero no hay consenso sobre un protocolo. El objetivo principal del presente trabajo fue evaluar la utilidad de varias técnicas serológicas para el diagnóstico y seguimiento de la infección crónica y congénita por T. cruzi y para caracterizar los genotipos de T. cruzi en una población latinoamericana atendida en hospitales de Barcelona (España). Los resultados mostraron que el Inmuno-ensayo de Micropartículas Quimioluminiscentes (CMIA), con una sensibilidad del 100% en pacientes crónicos, permitió el diagnóstico correcto de la mayoría de las muestras cuando se aplicaba como única técnica. Sólo las muestras en zona gris y positivas con un resultado de ≤ 6 unidades relativas de luz/punto de corte (S/CO) necesitarían ser confirmadas. En los recién nacidos no infectados, se observó una tendencia decreciente continua de anticuerpos IgG pasivos pero ninguno de los tests serológicos utilizados serorevertió en todos los casos antes de los 12 meses. A partir de ese momento, todas las pruebas serológicas obtuvieron resultados negativos en todas las muestras analizadas excepto CMIA. Los protocolos propuestos permitirían importantes ahorros en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas y en el manejo y el control de la enfermedad. Los diagramas de identificación basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se mostraron muy útiles para caracterizar las UDTs de T. cruzi durante la infección aguda pero no lo suficientemente sensibles para el análisis de pacientes con cargas parasitarias bajas. En cambio, la secuenciación del ADN satélite (ADNsat) no permitió discriminar las poblaciones a nivel de una única UDT, pero sí aumentar el número de casos caracterizados en pacientes crónicos. La UDT más identificada fue TcV, común en Bolivia y predominante en sangre periférica.
- TesiTransmisión por transfusión de la enfermedad de Chagas. Estudio de la carga parasitaria y viabilidad de Trypanosoma cruzi en los componentes sanguíneos y valoración de métodos de reducción de patógenos mediante herramientas moleculares(Universitat de Barcelona, 2016-09-23) Cancino Faure, María Beatriz; Fisa Saladrigas, Roser; Riera Lizandra, Ma. Cristina; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia, Sanitat i Medi Ambient[spa] La investigación desarrollada en el presente trabajo se ha dirigido a estudiar la presencia y viabilidad de Trypanosoma cruzi en diferentes componentes sanguíneos, para profundizar en el conocimiento de la transmisión por transfusión (TT) de la enfermedad de Chagas, así como a diseñar y optimizar una herramienta molecular basada en la detección de DNA (PMA-qPCR), que permita diferenciar parásitos vivos y muertos aplicada a ensayos de viabilidad del parásito de manera simple, precisa y de fácil aplicación sobre distintas matrices. La presencia del parásito se ha estudiado en sangre y en componentes sanguíneos (plasma y plaquetas obtenidos por aféresis) de donantes seropositivos de la Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears, provenientes de zonas endémicas de la enfermedad de Chagas que residen en las islas Baleares. Además, se han llevado a cabo estudios en sangre total experimentalmente infectada y separada mediante fraccionamiento clásico para conocer su distribución en plasma, placa leucoplaquetaria y fundamentalmente en concentrado de hematíes, que ha sido recientemente citado como un componente sanguíneo involucrado en un caso de transmisión por transfusión de T. cruzi. Así mismo, se han evaluado los actuales métodos de leucorreducción y tecnologías de reducción de patógenos utilizados en los bancos de sangre, para valorar su efectividad en disminuir tanto la carga parasitaria como la viabilidad del parásito en estudios experimentales. Para llevar a cabo estos estudios se han utilizado herramientas moleculares sensibles y específicas que han permitido detectar y cuantificar tanto DNA como RNA del parásito, mediante tecnologia qPCR con sondas TaqMan y con SYBR Green. La búsqueda de posibles donantes seropositivos con parásitos detectables en sangre, para ser incluidos en el estudio, ha permitido obtener datos sobre la seroprevalencia de la enfermedad de Chagas en los donantes, siendo ésta de 1,9%. Además ha permitido detectar que el 60,9% presentaban parasitemia, con cargas menores a 1 parásito equivalente por mL. El estudio para determinar la presencia del parásito en los componentes sanguíneos obtenidos mediante plaqueto/plasmaféresis, ha mostrado que la mayor carga parasitaria se localiza en las plaquetas (5,33±6,12 parásitos equivalentes/mL) y no en el plasma, con un valor promedio cinco veces mayor que en sangre periférica (0,42±0,32 parásitos equivalentes/mL), lo que confirma el riesgo de TT asociado a este componente sanguíneo ya documentado en los diferentes casos publicados de transmisión. En el estudio experimental de sangre total infectada y separada mediante fraccionamiento clásico, los componentes sanguíneos con mayor concentración de parásitos detectados han sido la placa leucoplaquetaria y el concentrado de hematíes sin leucorreducir. La elevada carga parasitaria encontrada en el concentrado de hematíes sin leucorreducir evidencia el riesgo asociado a TT por este componente sanguíneo, que decrece significativamente cuando es sometido a leucorreducción mediante filtración, observándose una reducción de 99,9%. Por otro lado, los estudios realizados en sangre total infectada experimentalmente para evaluar la efectividad de un filtro leucorreductor, han mostrado la presencia de un remanente de parásitos viables, que no han sido detectados después de haber sido sometidos a la tecnología de reducción de patógenos basada en riboflavina y luz ultravioleta. Ello indica el interés de utilizar ambos métodos de modo conjunto para eliminar el riesgo de TT. La importancia de conocer la viabilidad de las formas parasitarias y simplificar las metodologías de estudio, llevó a diseñar y a optimizar la técnica cruzi PMA-qPCR que utiliza el colorante propidio monoazida (100 mM PMA), capaz de unirse covalentemente al DNA e impedir su posterior amplificación, pero incapaz de atravesar membranas íntegras de células vivas. El método ha permitido una reducción promedio de la señal de qPCR de 2,5 unidades de logaritmos y un porcentaje de reducción de 98% entre en las concentraciones de parásitos 10 5 viables y no viables ensayados (10-1 x10 parásitos/mL). Esta técnica permite diferenciar entre epimastigotes de T. cruzi vivos y muertos, por lo que puede ser utilizada como un método de viabilidad y cuantificación mediante detección de DNA, aplicable tanto en diagnóstico como investigación.