Tesis Doctorals - Departament - Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències

URI permanent per a aquesta col·leccióhttps://hdl.handle.net/2445/36063

Estadístiques

Examinar

Mostrant 1 - 20 de 42

Primary and secondary immunodeficiencies of the IL-12/IFN-γ axis
(Universitat de Barcelona, 2018-05-18) Esteve-Solé, Ana; Alsina Manrique de Lara, Laia; Juan Otero; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[eng] IL-12/IFN-γ axis is a principal pathway for intramacrophagic pathogens immunity such as leishmania or mycobacteria. Alterations in this axis, being both congenic (causing the primary immunodeficiency Mendelian Susceptibility to Mycobacterial Disease, MSMD) or acquired (treatment with anti-TNF-α drugs) cause susceptibility to this type of microbes. MSMD causes susceptibility mainly to non-pathogenic mycobacteria, salmonella and candida; besides, MSMD- causing mutations have been detected in Mycobacterium tuberculosis and Leishmania patients. On the other hand, the death of an anti-TNF-α in-utero exposed infant after BCG vaccination together with the effect of anti-TNF-α drugs in tuberculosis reactivation in adults and the known tole of TNF-α in B cell maturation reveal the need for an in-depth study of in-utero exposition to anti-TNF-α drugs. With that our hypothesis is that patients with extrapulmonary Mycobacterium tuberculosis infection or visceral leishmaniasis have a primary dysfunction of the IL-12/IFN-γ axis and that exposure to anti-TNF-α antibodies during whole pregnancy in children born to mothers with inflammatory bowel disease affects the normal development of the neonatal immune system, conferring a secondary immunodeficiency, which includes a dysfunction of the IL- 12/IFN-γ axis. Both extrapulmonary tuberculosis (n=23) and visceral leishmaniasis (n=24) patients presented alterations in the IL-12/IFN-γ pathway; however, we did not detect any complete defect. Concretely, the patients with extrapulmonary tuberculosis had a diminished response to IFN-γ while visceral leishmaniasis patients had a diminished production of IFN-g. Genetic study of these patients to unravel mutations causing partial forms of susceptibility to intramacrophagic infections is then needed. Besides, we detected an IL-12Rβ1 defect in a Peruvian patient that was misdiagnosed as multi-resistant tuberculosis, being a disseminated infection by the vaccine strain BCG. After the detection of the genetic defect, the patient was transferred to the National Institute of Health in the USA, where she received the appropriate treatment and the microbiological diagnosis was corrected resulting in the resolution of the infection. This case remarks the fact that suspicion of this forms of immune deficiency and their detection changes the prognostics and outcome of the patient. The study of the effect of anti-TNF-α on the exposed infant immune system (n=7) revealed a T and B cell maturation defect that was corrected at 12 months, normal cell proliferation after mitogen stimulation and normal immunoglobulin production and vaccine response without an increase of severe infections. On the other hand, Treg cell frequency was low in exposed infants, without reaching normalization at 12 months of age. Treg cell frequency in neonates inversely correlated with anti-TNF-α through level in the mother during third trimester of pregnancy and with T cell proliferation after a mild mitogen stimulation. These data with the increased atopia/allergy in the studied infants suggest the need of a long-term follow-up for Treg cells and the advent of immune dysregulation events. Antimycobacterial response was diminished in exposed infants and not totally recovered after washing the drug from the blood in the culture. On the other hand, coinciding with the decrease of the drug levels in blood, the production of IL-12, IFN-γ and TNF-α increased. We conclude that the effects of anti-TNF-α exposure during pregnancy are not permanent and that BCG vaccination in these population should be avoided until, at least, 12 months of age. By last, the transition between the intra- and extra-uterine world is a special life-situation where the immune system plays a major role. We studied it in healthy cord blood donors, with special attention to the IL-12/IFN-γ pathway and B cell compartment, including regulatory B cells (Breg). Breg cells, defined as CD24hiCD38hi B cells, were expanded in cord blood, with capacity to produce IL-10 and to inhibit IL-4 and IFN-γ production by T cells with a similar phenotype when compared with adult Bregs. Besides, response to mycobacterial challenge was diminished. Interestingly, the diminished production of IFN-γ was associated with Breg cell frequency, opening the door to new research studying the role of these cells in different neonatal conditions as well as in cord blood derived stem cell transplantation.
Papel del citoesqueleto de actina en la regulación de la H+-ATPasa vacuolar de complejo de Golgi
(Universitat de Barcelona, 2014-12-16) Serra-Peinado, Carla; Egea Guri, Gustavo; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[spa] La vía secretora se caracteriza por la acidificación progresiva de sus orgánulos, este gradiente es crucial para funciones tales como la modificación postraduccional de proteínas o el trafico de membranas. El principal responsable de generar y mantener este gradiente es la H+-ATPasa vacuolar (V-ATPase), que transporta protones desde el citosol hacía el interior del Golgi. Esta bomba está compuesta de dos dominios, el dominio V1 y el V0, a su vez ambos están formados por varias subunidades. Se ha descrito que las subunidades B y C del dominio V1 contienen dominios de unión a actina. Existen significantes similitudes entre los efectos subcelulares producidos por la despolimerización de actina y la inhibición farmacológica de la V-ATPasa: Alteración de transporte vesicular Golgi-Retículo endolplasmatico y Golgi-membrana plasmática, alcalinización del complejo de Golgi, dilatación de las cisternas de Golgi. Teniendo en cuenta que dos subunidades de la V-ATPasa tienen la capacidad de unirse a los microfilamentos de actina, nosotros hipotetizamos que estos podrían participar en la homeostasis del pH de Golgi a través de la regulación de la V-ATPasa, particularmente la actina podría estar manteniendo la asociación de los dominios V1 y V0. Generamos un constructo de la subunidad B conjugado con GFP (B2-GFP) que se incorporaba en el dominio V1. Observamos que este constructo se localizaba en los compartimentos distales del complejo de Golgi y que translocaba al citosol al despolimerizar la actina. Diferentes ensayos bioquímicos nos sirvieron para confirmar que la despolimerización de actina inducía la disociación de los dominios V1 y V0 de la V-ATPasa. Además, detectamos interacción entre la actina y las subunidades B y C. Finalmente, está descrito que la V-ATPasa se localiza en los dominios ricos en colesterol de la membrana plasmática y que el citoesqueleto de actina juega un papel importante en la organización de estos dominios, lo que observamos fue que la desorganización de los dominios ricos en colesterol inducía una subida del pH de Golgi. Con todo, concluimos que la actina regula el pH de Golgi a través del mantenimiento de la asociación de los dos dominios de la ATPasa gracias a su unión a las subunidades B y C además de su papel en el mantenimiento de los dominios ricos en colesterol
Implicacions funcionals i terapèutiques de les interaccions moleculars mitjançades per CD5 i CD6 en les respostes immunitàries
(Universitat de Barcelona, 2016-02-18) Orta Mascaró, Marc; Lozano Soto, Francisco; Carreras Margalef, Esther; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[cat] Els receptors de superfície CD5 i CD6 són receptors altament homòlegs amb dominis tipus scavenger, expressats principalment als timòcits i cèl·lules T madures. Els dos es troben associats al receptor de cèl·lules T (TCR) actuant com a moduladors de les senyals transmeses a nivell intracel·lular. Pel que fa a CD5, s’ha pogut determinar en diferents estudis la seva funció com a modulador negatiu de la senyal del TCR en timòcits i cèl·lules T madures a través del seu domini citoplasmàtic. En canvi, la manca de models animals ha fet que el rol biològic de CD6 encara sigui una incògnita, tot i que sí s’ha demostrat que esta implicat en la formació i estabilització de la sinapsi immunològica a través de la unió al seu lligand CD166/ALCAM. Estudis del nostre laboratori van demostrar que curiosament les regions extracel·lular de CD5 i CD6 son capaces d’unir-se a fongs i bactèries, respectivament, tot i que la rellevància biològica d’aquesta interacció encara esta per determinar. Per tal d’aprofundir en el paper que juguen aquests dos receptors limfocitaris, el nostre laboratori ha adquirit recentment dos ratolins transgènics knock-out per CD5 i CD6 (CD5-/- i CD6-/-) amb la finalitat de caracteritzar fenotípica i funcionalment la nova línia de ratolins deficients per a CD6-/- tant en condicions normals como d’agressió biològica, i establir analogies fenotípiques i funcionals entre els nous ratolins CD6-/- i els prèviament descrits CD5-/-. L’anàlisi de les poblacions limfocitàries va revelar que els ratolins CD6-/- presentaven una disminució al timus de les poblacions CD4+ i CD8+SP (single positive), i que les cèl·lules doble positives CD4+CD8+ (DP) presentaven augmentada l’alliberació de calci intracel·lular en resposta a l’estimulació via TCR. Es van realitzar experiments amb quimeres mixtes de medul·la òssia que van demostrar una desavantatge selectiva de les cèl·lules T CD6-/- durant el desenvolupament, fet confirmat al observar que ratolins transgènics pel TCR (OT-I i Marilyn) presentaven una selecció de cèl·lules T anormal en absència de CD6. L’estudi de les cèl·lules T perifèriques CD6-/- va revelar que aquestes proliferaven menys in vivo però més in vitro davant l’estimulació del TCR amb anticossos anti-CD3, així com que els ratolins CD6-/- tenien més cèl·lules de tipus memòria/efectores i T reguladores. De manera rellevant, es va veure que els ratolins CD6-/- eren més sensibles a patir fenòmens d’autoimmunitat, degut a una artritis induïda per col·lagen més severa en aquests animals relacionada amb una patró de citocines pro-inflamatòries més elevat. Pel que fa a la resposta davant un xoc sèptic en la seva funció com a receptors de patòngens, els ratolins CD6-/- van presentar una major sensibilitat a la mort per peritonitis polimicrobiana, però no en canvi els ratolins CD5-/- a una peritonitis induïda per derivats fúngics. Un estudi més detallat va revelar que la soca de ratolins C57BL/6 era deficient en la secreció d’IFN-γ comparat amb la soca CD1, i que l’administració d’IFN-γ recombinant juntament amb la proteïna CD5 soluble augmentava la supervivència dels animals de manera estadísticament significativa. En conclusió, en aquesta tesi doctoral s’ha demostrat que CD6 regula el llindar d’activació dels timòcits i de les cèl·lules T perifèriques, i que l’expressió d’aquest receptor dóna resistència a fenòmens autoimmunitaris i a la mort per peritonitis polimicrobiana. Per altra banda, també s’ha vist que l’administració d’IFN-γ recombinant soluble juntament amb la proteïna CD5 protegeix de la mort induïda per un xoc sèptic induït per derivats fúngics.
New mechanisms involved in the DNA replication stress response of non-transformed human cells
(Universitat de Barcelona, 2016-04-29) Ercilla Eguiarte, Amaia; Agell i Jané, Neus; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[eng] The cell cycle, the group of processes involved in the duplication and division of a cell in two daughter cells is essential for all organism existence. The correct regulation of these processes is crucial to guarantee genome integrity and cell survival. From the different cell cycle phases, the S phase is the most vulnerable to the acquisition of DNA damage since it is the phase in which the DNA is replicated. Alterations in DNA replication dynamics result in the accumulation of replication stress, one of the major sources of genomic instability, a hallmark of cancer. In this sense, cells have developed complex surveillance mechanisms to ensure stabilization and repair of forks, to coordinate these functions with cell cycle, and thus, to prevent cell division in the presence of unreplicated or damaged DNA. By doing so, these mechanisms will try to overcome the damage, and if so, the DNA replication stress response will promote replication resumption. By contrast, in the cases of persistent damage, cells are withdrawal from the cell cycle either by apoptosis or senescence. The correct activation and regulation of all these mechanisms is essential to prevent the acquisition of genomic instability and the oncogenic transformation. The pathways involved in DNA damage detection and signaling have been extensively studied in tumor cells. However, the response to replication stress, especially in non-transformed human cells, is still poorly understood. Therefore, in order to gain a better understanding of the pathways involved in this response, the main objective of this thesis has been to study and characterize new mechanisms involved in the DNA replication stress response of non-transformed human cells, as well as to analyze their contribution towards safeguarding genome integrity. Combining cellular and molecular approaches, together with several replication stress inducing agents, we have characterized new DNA replication stress response mechanisms that prevent replication resumption upon severe replication stress. For instance, we have described that APC/CCdh1 ubiquitin ligase is prematurely activated in S phase, to prevent new origin firing, in response to a prolonged DNA replication inhibition that results in the processing of replication forks into double strand breaks. Additionally, using an approach that has allowed us to define the changes at replication fork level between an acute and prolonged replication stress, we have seen that replication forks suffer several remodeling and processing events that abrogate their ability to restart after severe replication stress. Notably, our results suggest that this loss in the ability to resume replication under these conditions may act as a mechanism to safeguard genome integrity in non-transformed human cells. Collectively, the results of this thesis contribute to have a better understanding of the mechanisms involved in the DNA replication stress response of non-transformed human cells, opening new doors for the development of future therapies.
Study of mitochondrial dysfunction mechanisms in Huntington's disease striatal degeneration
(Universitat de Barcelona, 2016-01-15) Cherubini, Marta; Ginés Padrós, Silvia; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[eng] Huntington's disease (HD) is an autosomal-dominant inherited neurodegenerative disorder, characterized by progressive behavioral, motor and cognitive deficits (HDCRG, 1993; Ross & Margolis, 2001). The predominant neuropathological hallmark of HD is the selective loss of medium spiny neurons within the striatum that extends to other brain regions with the progression of the disease (Martin & Gusella, 1986). Although mutant huntingtin (mHtt) represents a key factor in the pathogenesis of the disease, the molecular mechanisms underlying the preferential vulnerability of the striatum to mHtt toxicity remain unclear. Compelling evidence suggest that mitochondrial defects may play a crucial role in the disease, however, it is still debated whether mitochondrial dysfunction represents just an epiphenomenon of the cellular degeneration or it has an actual pathogenic role. In this Thesis, the general purpose was to identify possible mitochondrial impaired mechanisms and to investigate their role in the selective striatal vulnerability of HD, in order to provide important insights for the development of new therapeutic strategies. The first aim was to clarify whether mitochondrial injuries perpetrate the dopaminergic neurotoxicity in HD striatal degeneration. Since Cdk5 has been proposed as a critical regulator of mitochondrial fission (Meuer et al., 2007) and as a deleterious player in the striatal vulnerability upon dopamine signalling (Paoletti et al., 2008), we hypothesize a new detrimental role for Cdk5 in HD pathology by mediating dopaminergic neurotoxicity through deregulation of mitochondrial dynamic processes. On the other hand, several studies have proposed mitochondrial Ca mishandling as a component of Ca controversial and a conclusive cause remains uncertain. We propose that the propensity of mitochondria to undergo fragmentation in HD could result in the disruption of ER-mitochondria contacts, which are essential for the proper buffering of Ca whether defects in ER-mitochondria associated membranes could be responsible for the alteration of mitochondrial Ca handling in HD. dyshomeostasis in HD. However, the results appear 2+ 2+ by mitochondria. Therefore, the second aim of this study was to investigate.
Rac1 y Calmodulina regulan la dinámica de membrana durante la endocitosis independiente de Clatrina
(Universitat de Barcelona, 2016-01-28) Soriano Castell, David; Tebar Ramon, Francesc; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[spa] El fosfolípido PI(4,5)P2 ha sido descrito ampliamente como un factor clave en la endocitosis. De hecho, numerosas proteínas endocíticas contienen dominios de unión específicos para PI(4,5)P2. La dinámica de su metabolismo está finamente regulada por diversos enzimas que pueden fosforilarlo, defosforilarlo, hidrolizarlo o sintetizarlo a partir de precursores, cambiando su concentración en dominios específicos de la membrana. En los primeros pasos de la endocitosis, la concentración de PI(4,5)P2 aumenta y recluta clatrina u otros tipos de proteínas de cubierta o asociadas a procesos de remodelación de membrana, dando lugar a una invaginación. Más tarde, los niveles de PI(4,5)P2 deben reducirse para completar el proceso de formación de vesículas. En los últimos años, nuestro grupo ha descrito como la calmodulina (CaM) está regulando la interacción entre Rac1 y PIP5K, el principal enzima productor de PI(4,5)P2. La inhibición de la CaM, que es el sensor de calcio (Ca2+) más importante en células no musculares, induce la formación de invaginaciones tubulares ricas en PI(4,5)P2 provenientes de la membrana plasmática, que parecen formar parte de un proceso endocítico independiente de clatrina. Sin embargo, también se observó que la sobreexpresión del Rac1 constitutivamente activo (Rac1G12V) inhibe las tubulaciones inducidas por la inhibición de CaM, lo que podría deberse a la acción de efectores de Rac1 relacionados con el metabolismo de PI(4,5)P2, como la fosfolipasa C (PLC), o relacionados con la dinámica del citoesqueleto. Durante esta tesis, hemos demostrado el requerimiento de PI(4,5)P2 en la formación de los túbulos endocíticos, y hemos descrito como la CaM puede estar regulando sus niveles a través de la regulación de Rac1 y posiblemente de PKC, específicamente en las balsas lipídicas, donde se producen la mayoría de procesos endocíticos independientes de clatrina. La dinámica de las adhesiones focales, que vinculan el citoesqueleto con la matriz extracelular a través de la integrina, está también regulada por la endocitosis durante la migración celular. Existe además una estrecha regulación recíproca entre las RhoGTPasas y el tráfico de integrinas, que se extiende a lo largo del eje anteroposterior de la célula en migración, en el que generalmente Rac1 está activado en la parte anterior, y RhoA en la parte posterior. Los análisis de internalización realizados nos han permitido descubrir que las tubulaciones inducidas por PI(4,5)P2 son una vía de entrada de beta1-integrina, que aceleran su internalización y la excluyen de los compartimentos endosomales tempranos, impidiendo posiblemente un reciclaje rápido hacia la membrana plasmática. La activación constitutiva de Rac1 impide esta entrada rápida a través de los túbulos. Los sitios de endocitosis están estrechamente ligados al citoesqueleto de actina, ya que éste puede contribuir a la deformación, invaginación o rotura de la membrana. La cortactina modula la dinámica del citoesqueleto de actina durante la CDE y la CIE, en asociación con diversas proteínas como WASP, dinamina o Arp2/3. Se sabe que la cortactina requiere de Rac1 para ser translocada a la membrana plasmática pero no se conoce bien el mecanismo. Asimismo, la tensión de la membrana plasmática es también un elemento clave en la regulación de la internalización, estimulándose la endocitosis en regiones con una baja tensión de membrana. La miosina, en especial la miosina II de células no musculares, es, junto con la actina, uno de los principales reguladores de la tensión de membrana, especialmente durante la migración celular. El estudio de la función de cortactina y miosina permitió demostrar que la actividad de Rac1 regula negativamente la formación de las invaginaciones tubulares inducidas por PI(4,5)P2. Hemos demostrado que la acción de POR1, un efector conocido de Rac1, media la translocación de cortactina a la membrana plasmática. Además, se ha descrito por vez primera una activación directa de ROCK1 por parte de Rac1, que pemite la activación de la miosina y su asociación con el citoesqueleto de actina, lo cual es necesario para la inhibición de las tubulaciones por Rac1 activo.
Estudio y caracterización de la nueva quinasa dependiente de calmodulina: CKK2
(Universitat de Barcelona, 2015-12-16) Yance Chávez, Tula del Carmen; Aligué i Alemany, Rosa Maria; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[spa] La familia de CaM quinasas (CAMK por sus siglas en inglés) son una familia de quinasas, dependientes del complejo Ca2+/CaM importantes por su implicación en diferentes funciones como la transcripción de genes, la supervivencia/muerte celular (apoptosis), la organización del citoesqueleto, el aprendizaje y la memoria (Swulius & Waxham, 2008). Se ha demostrado la funcionalidad de esta familia de quinasas al expresar la CAMKII humana en Schizosaccharomyces pombe produciendo un arresto del ciclo celular. Tambien se ha descrito en S. pombe una quinasa a homologa a la CAMKI de mamíferos funcional, la cual necesita para su activación la unión del complejo Ca2+/CaM y la fosforilación por una quinasa upstream. Nuestro grupo encontró que la fosforilación de Cmk1 en respuesta a Ca2+ desaparece al mutar la CAMKK, ckk2 (Cisneros-Barroso et al., 2014). En este trabajo planteamos como primer objetivo determinar si la fosforilación de Cmk1 es debida a la actividad de la quinasa Ckk2 de manera directa. Encontramos que fosforila a Cmk1 in vivo e in vitro, como su homóloga en mamíferos la CAMKK2, estableciendo una cascada de las CAMK en S. pombe. Encontramos también que Ckk2 es una quinasa dependiente del complejo Ca2+/CaM constituyéndose como una CAMK propiamente dicha. La viabilidad de un mutante nos puede indicar si el gen mutado esta implicado en la vía del estrés al que es sometido. Al evaluar el mutante Δckk2 encontramos que la deleción de ckk2 compromete la viabilidad celular frente agentes que modifican el citoesqueleto (tiabendazol, Latrunculina) y es resistente frente agentes que compromete la pared celular (calcofluor). Del mismo modo quisimos evaluar el mutante Δckk2 en condiciones de deprivación de nutrientes y encontramos que la deleción de ckk2 no afecta la viabilidad celular, a diferencia de Ssp1, otra CAMKK en S. pombe (Hanyu et al. 2009), sin embargo es importante para la citocinesis. Observamos un retraso en la citocinesis en condiciones de deprivación de glucosa reflejado en un aumento del índice de septación entre las 4 y 12 horas de deprivación, y en condiciones de deprivación de nitrógeno encontramos que el mutante Δckk2 presenta un alto índice de septación con respecto a la cepa salvaje (26% y 0% respectivamente); esto nos indicaría que Ckk2 probablemente esté implicada en algún proceso que dé lugar a la citocinesis. Addicionalmente, encontramos que la expresión de ckk2 aumenta tanto en condiciones de deprivación de glucosa como de nitrógeno, y este aumento se ve reflejado a nivel proteico. La proteína aumenta especialmente a partir de las 12 horas en deprivación, y además se observa una modificación pos-traduccional correspondiente a una sumoilación. Del análisis de la secuencia encontramos una lisina la K202, consenso de sumoilación (Beauclair et al. 2015; Zhao et al. 2014) y que se encuentra conservada en las CAMKK2, la homóloga en mamíferos de esta K202 está descrita como una lisina de ubiquitinación (Kim et al. 2011). Nosotros hemos estudiado la ubiqüitinizacón de nuestra proteína mediante anticuerpos pero no parece ubiquitinada. Por otra parte, tampoco está descrito que la CAMKK de mamíferos se encuentre sumoilada en alguna condición. Las modificaciones por sumo pueden alterar la actividad de una proteína, su localización, y/o estabilidad. En algunos casos sumo y ubiquitina tienen roles opuestos, donde la sumoilación protege la proteína de degradación ocupando la misma lisina para la ubiquitinación (Miteva et al. 2010). Es presumible pensar que en condiciones ricas de nutrientes Ckk2 sea diana de ubiquitina y se degrade, explicando los bajo niveles de la proteína en medio rico; y por el contrario en condiciones de deprivación de nutrientes, se favorezca su sumoilación para estabilizarla, en acorde con la acumulación de Ckk2 a lo largo del tiempo.
Characterization of morphogenes and new transcription factors involved in the development of striatal medium spiny neurons
(Universitat de Barcelona, 2015-11-12) Pardo Muñoz, Mònica; Canals i Coll, Josep M.; Martín Ibáñez, Raquel; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[eng] The striatum is one of the brain structures that controls body movement. In humans the striatum consists of two nuclei, the caudate and putamen which are separated by the internal capsule, while in mice it is a single structure. Its neuronal population is defined by two types of cells: Medium spiny neurons (MSNs) and Interneurons. MSNs comprise 90-95% of the striatal cell population, and can be classified as striatonigral or striatopallidal neurons. During telencephalic development, the generation of striatal MSNs occurs in the Lateral Ganglionic Eminence (LGE) where there are two defined zones: namely the Germinal Zone (GZ) that consists of progenitor cells, and the Mantle Zone (MZ) where the progenitors have differentiated into postmitotic cells. Several transcription factors have been described to be involved in the generation of striatal MSNs, such as Gsx1/2, Ascl1, Dlx1/2, Dlx5/6, Ebf1 and Ikaros. However, there are still a lot of factors that may participate in the striatal development which function or expression has not been yet elucidated. Thus, the main objective of this thesis is to study the striatal development characterizing the function and expression of some striatal genes as well as finding out new candidate genes and mechanisms that might be controlling this process. First, we characterized the role of Nolz1, showing a high expression in the progenitors of the SVZ and with less intensity in the MZ of the LGE. Its expression together with several experiments indicates this gene could be playing a dual role promoting the progenitors to exit the cell cycle and inducing their differentiation into neurons. Furthermore, Nolz1 might be promoting the differentiation of the neural precursors through the retinoic acid signalling pathway. We continue characterizing the striatal genes studying Helios, which expression was detected between the SVZ and MZ border, although the higher levels were observed in the postmitotic region. First, Helios might arrest neural precursors in the G1 phase of the cell cycle, and second, it would also be promoting the differentiation into striatopallidal MSNs. In Helios knockout mice, it is observed an alteration of the striatal neurogenesis, accompanied by a reduction in the number of born neurons and consequently increasing the number of proliferative precursors. These alterations during development promote an aberrant neuronal differentiation, causing cell death and a reduction in the adult striatopallidal MSNs. In order to explain the complex network of genes that control the striatal development, we performed a transcriptomic analysis of striatal samples during different developmental stages (E12.5, E14.5, E16.5 and E18.5) and separating both striatal regions (GZ and MZ). From the analysis we determined that the striatum can be explained by six gene expression profiles or categories, each of them represented by a group of genes that develop specific striatal functions. These categories are: Early LGE progenitors, Late GZ progenitors, Fate specification, Neuronal differentiation, Maturation and Reorganization. To establish the relation between human and mouse striatum, we compared our mice samples with human striatal samples from a data base, showing similitude between species. From the comparison we could determine new candidate genes to participate in the differentiation of mouse and human striatal MSNs, such as Zfp521/ZNF521 and FOXO1. The characterization of Zfp521/ZNF521 in mouse and human determined it is expressed by striatal postmitotic neurons, and specifically in mouse we could observe that it is expressed by striatonigral MSNs. On the other hand, FOXO1 is expressed in both progenitors and human striatal MSNs. In conclusion, with the proposal of a striatal model and the characterization of the expression and function of some striatal genes such as Nolz1, Helios, Zfp521/ZNF521 and FOXO1, we bring one more piece to comprehend the complex puzzle that forms the striatal development.
Epithelial IL-1R2 acts as a homeostatic regulator during remission of ulcerative colitis
(Universitat de Barcelona, 2015-10-29) Mora Buch, Rut; Salas Martínez, Azucena; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[eng] Ulcerative colitis (UC) is an idiopathic chronic inflammatory disease of the large intestine. In most patients UC runs a remitting and relapsing course, with periods of active disease followed by phases of inactivity. Although current therapeutic options can induce remission in about 30-70% of patients, continuous pharmacological treatment is often required to avoid disease relapse. In order to promote sustained remission, endogenous mechanisms that support intestinal homeostasis and contain arising local inflammation must be identified. We aimed to identify endogenous regulatory mechanisms that may promote disease remission. Transcriptional and protein analysis of the intestinal mucosa revealed that the IL-1 decoy receptor, interleukin-1 receptor type 2 (IL1R2), was up-regulated in remission compared to active UC and controls. IL-1R2 serves as a potent inhibitor of IL- 1 signaling by competing with IL-1R1 for IL-1, and by subsequently forming a complex with IL-1RAcP, thereby sequestering both the ligand and the accessory protein required for signal transduction. We identified both IgA (but not IgG ) plasma cells and mucosal epithelial cells as the main producers of IL-1R2 in human colon. In order to determine IL-1R2 expression by epithelial cells, we used flow cytometry to quantify IL-1R2 production by the epithelial compartment in colonic biopsies. Samples from the involved mucosa of + UC in remission showed a significantly higher percentage of intracellular, IL-1R2 cells - + among CD45 Ep-CAM epithelial cells compared to control, uninvolved UC, and active UC samples. Immunostaining analysis of colonic mucosa revealed a gradient expression of IL-1R2 along the crypt. In vitro expanded colonic stem cells (CoSCs) can be induced to differentiate by removing Wnt/beta-catenin activating signals from the culture media. Using this system, we demonstrated that both IL1R2 gene transcription and IL-1R2 protein secretion is significantly increased upon CoSCs in vitro differentiation. Using an ex vivo culture of intestinal epithelial crypts, we provide here novel evidence for the role of beta-catenin signaling in repressing IL-1R2 transcription and translation. Canonical Wnt signals activate beta-catenin and are critically involved in stem-cell proliferation and survival at the base of the intestinal crypts. Moreover, blocking IL-1R2 in isolated colonic crypt cultures of UC patients in remission and T cell cultures stimulated with biopsy supernatant from UC patients in remission boosted IL-1β-dependent production of inflammation-related cytokines. Our final objective was to address whether IL-1R2 overexpression could be related to disease outcome. In order to test this possibility, we looked at IL1R2 transcription in a cohort of UC patients in endoscopic and histologic remission that were followed up for one year after taking biopsies from the distal colon. IL1R2 transcription was significantly lower in the group of patients that relapsed during the follow-up period of 12 months compared with those patients that remained in endoscopic remission for the same amount of time. Interestingly, in patients who relapsed, IL1R2 expression negatively correlated with IFNG transcription. These data suggest that IL-1R2 may play a role in preventing disease relapse. Collectively our results reveal that the IL-1/IL-1R2 axis is differentially regulated in the remitting intestinal mucosa of UC patients. We hypothesize that IL-1R2 in the presence of low concentrations of IL-1 may act locally as a regulator of intestinal homeostasis.
Tolerogenic dendritic cell-based immunotherapy in Crohn’s disease
(Universitat de Barcelona, 2015-03-26) Cabezón Cabello, Raquel; Benítez-Ribas, Daniel; Panés Díaz, Julià; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[spa] Esta tesis doctoral estudia el proceso de generación de células dendríticas tolerogénicas en grado clínico, con el objetivo de establecer un protocolo destinado al tratamiento de la enfermedad de Crohn. El estudio realizado ha permitido la caracterización de dichas células y sus propiedades tolerogénicas, incluyendo la descripción novedosa de un marcador de células tolerogénicas y el estudio de sus propiedades funcionales relacionadas con la inducción de tolerancia.
Estudio de la función de Annexina A6 en el hígado
(Universitat de Barcelona, 2015-06-10) Alvarez Guaita, Anna; Enrich Bastús, Carles; Rentero Alfonso, Carles; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[spa] Annexina A6 (AnxA6) es una proteína de unión a fosfolípidos de membrana de forma dependiente de calcio. Está implicada en múltiples procesos celulares como la homeostasis de colesterol y el tráfico intracelular. Partiendo de que AnxA6 es una de las proteínas más abundantes en el hígado, representando el 0.25% del total, el principal objetivo de esta tesis fue el estudio del papel de AnxA6 en este órgano a partir de ratones genoanulados para la proteína (AnxA6-/-). Teniendo en cuenta la fisiología y arquitectura comparable a los ratones WT de los hígados en ausencia de AnxA6, se procedió al estudio de AnxA6 durante el proceso de regeneración hepática tras la realización de una hepatectomía parcial (HP) de 2/3. Sorprendentemente, el 80% los ratones AnxA6-/- no sobrevivían más allá de las 72 horas post-HP. La regeneración hepática consiste en la activación de los hepatocitos por diversas citoquinas y factores de crecimiento que permiten la proliferación de las células hepáticas tras un daño hepático o una resección, como es el caso. En paralelo, el hígado y, el organismo en general, sufren una serie de adaptaciones metabólicas para mantener la homeostasis energética. El estudio del proceso de regeneración hepática demostró una menor expresión de las citoquinas TNFα e IL-6, encargadas de activar la transcripción de centenares de genes que podía estar compensada por una mayor activación del factor de crecimiento epidérmico (EGF). Además, se observó cierto retraso en la acumulación de lípidos en el hígado, necesarios para hacer frente a la elevada demanda energética derivada de la intensa proliferación. Tras la HP, los ratones experimentan una hipoglucemia muy elevada fruto de la resección del 60% de la masa hepática, con lo que se reducen los almacenes de glucógeno y los hepatocitos con capacidad gluconeogénica. A diferencia de los ratones WT, los AnxA6-/- tenían una drástica y rápida caída de los niveles de glucosa en sangre que no retornaban a valores normales, sugiriendo un coma hipoglucémico como causa de la baja supervivencia. Además, el análisis de la glucosa en sangre en los ratones AnxA6-/-, hizo evidente que en ausencia de AnxA6, y ante un estrés metabólico, los ratones eran incapaces de mantener la homeostasis de glucosa. Mediante el ayuno de los ratones AnxA6-/-, se determinó que el problema en la homeostasis de glucosa no era debido ni a una señalización defectuosa por parte de las hormonas insulina y glucagón, ni por una disfunción en el almacén y degradación de glucógeno. Estos resultados centraban a la gluconeogénesis (GNG) como la causa que provoca la hipoglucemia. La GNG es el proceso mediante el cual se produce glucosa a partir de sustratos no glucídicos como lactato, aminoácidos y glicerol. Así, se descartó un problema en la expresión de las enzimas clave de la GN; glucosa-6-fosfatasa, fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y fructosa-1,6-bisfosfatasa. En cambio, se observó una inhibición en la producción de glucosa a partir de alanina tanto in vivo en ratones hipoglucémicos como en hepatocitos aislados. La alanina es el principal sustrato de la GNG tanto en condiciones de ayuno como durante la regeneración hepática. Está inhibición se determinó debida a una deficiencia en la captación de alanina, tal como se observó en hepatocitos aislados. El transportador de aminoácidos SNAT2, uno de los principales transportadores de alanina, entre otros aminoácidos neutros, se ha descrito esencial durante la regeneración hepática y el ayuno. En estas situaciones se sobreexpresa el transportador y se transloca a la membrana plasmática de los hepatocitos. Tras el ayuno, los hepatocitos deficientes en AnxA6 no presentan niveles de SNAT2 en la membrana sinusoidal indicando un impedimento en el tráfico del transportador. Por último, se ha determinado mediante la técnica de pull down la interacción entre AnxA6 y SNAT2. De manera que se propone un mecanismo mediante el cual AnxA6 interacciona con SNAT2 dirigiéndolo a la membrana plasmática. Con estos resultados, hemos determinado la implicación por primera vez de AnxA6 en el metabolismo de la glucosa a través de alanina. Así, sugerimos que en ausencia de AnxA6, el transportador SNAT2 no se transloca a la membrana plasmática, quedando retenido en algún compartimento celular. De esta forma, se inhibe la GNG a partir de alanina impidiendo la producción de glucosa y provocando una situación de hipoglucemia, que en el caso de la HP podría llevar a la muerte del animal.
Description and Validation of New Therapeutical Targets to Prevent Neurodegenertlion and Cognitive Deficits in Huntington's Disease
(Universitat de Barcelona, 2014-11-27) Puigdellívol Cañadell, Maria del Mar; Ginés Padrós, Silvia; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[cat] La malaltia de Huntington (MH) és un desordre neurodegeneratiu caracteritzat per la disfunció i mort neuronal de regions específiques del cervell. La regió més afectada és l’estriat (nuclis caudat i putamen en humans), tot i que en estadis més avançats de la malaltia s’ha descrit una atròfia i pèrdua neuronal del còrtex cerebral i hipocamp (Vonsattel et al., 1985;Vonsattel and DiFiglia, 1998). La temprana disfuncionalitat de les neurones hipocampals i corticals es creu crítica per restablir les deficiències cognitives i de memòria en aquesta patologia. La malaltia s’hereta de forma autosòmica dominant i és causada per la mutació del gen IT15, localitzat en el braç curt del cromosoma 4 (4p.16.3), que codifica per la proteïna anomenada huntingtina (htt). Aquesta mutació va ser identificada l’any 1993 com una expansió de repeticions del triplet CAG que codifiquen per una regió poliglutamínica (poliQ) a l’extrem N-terminal de la proteïna htt (350KDa) (HDCRG, 1993). En individus sans, el nombre de repeticions oscil·la de 6 a 35; quan el nombre de repeticions d’aquest triplet és superior a 40, l’individu desenvoluparà la malaltia. Les primeres manifestacions de la malaltia solen produir-se als 35 anys d’edat conduint a la mort 15-20 anys després de l’aparició dels símptomes (Bates, 2003;Martin and Gusella, 1986). La simptomatologia inclou disfunció motora, associada majoritàriament a l’atròfia estriatal, acompanyada de trastorns cognitius i emocionals associats a l’afectació corticoestriatal i hipocampal que son de manifestació primerenca, fins i tot prèvia a la simptomatologia motora. Aquestes alteracions cognitives i emocionals constitueixen un dels pilars discapacitants en aquesta patologia, per això al llarg d’aquesta Tesi doctoral proposem un estudi dual que ens permeti definir diverses estratègies terapèutiques dirigides al tractament d’ambdues simptomatologies: motora i cognitiva. Si bé es coneix que aquesta mutació és la causant de la malaltia, avui en dia no es coneixen els mecanismes cel·lulars i moleculars responsables de la disfunció i mort neuronal en la MH. Diversos estudis han postulat que la pèrdua de funció de la proteïna wild-type i/o el guany de funció de la proteïna mutada (mhtt) juguen un paper clau en el desenvolupament de la malaltia. Així s’ha descrit que l’expressió de la proteïna huntingtina mutada resulta en l’alteració de diversos processos cel·lulars i moleculars, tals com l’agregació proteica, alteracions en el sistema ubiqüitinaproteosoma, desregulació en la maquinària transcripcional així com en la remodelació de la cromatina, alteracions en la síntesi proteica, reducció del suport tròfic, alteracions en les vies de senyalització intracel·lulars, alteració en la homeòstasis del calci, dany mitocondrial, excitotoxicitat, activació de caspases, alteracions en les interaccions proteïna-proteïna i alteració en la circuiteria neuronal (Cattaneo et al., 2005;Zuccato and Cattaneo, 2009). En aquesta Tesis ens hem centrat en estudiar alguns dels mecanismes moleculars implicats en la mort neuronal, així com en els dèficits cognitius i alteracions en la plasticitat sinàptica produïda per la presència de la huntingtina mutada, mitjançant l’estudi de les alteracions produïdes en: 1) maquinària transcripcional, 2) suport neurotròfic, 3) canvis estructurals en les sinapsis excitadores, 4) senyalització de proteïnes cinasa i fosfatasa i 5) formació d’heteròmers entre receptors acoblats a proteïnes G.
lmplicacló de p27 i PCAF en la regulació de la transcripció
(Universitat de Barcelona, 2014-12-05) Perearnau Garcia, Anna; Bachs Valldeneu, Oriol; Pujol Sobrevía, María Jesús; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[cat] En el nostre grup s’ha demostrat la interacció directa entre l’inhibidor de ciclines-CDKs p27 i l’acetiltransferasa PCAF. Aquesta interacció es produeix entre el domini HAT de PCAF i la regió que compren els aminoàcids 91-120 de p27. Aquesta regió conté un PRD (Proline Rich Domain, 91-96aa), un domini característic d’interacció entre proteïnes. En aquest treball hem comprobat que PCAF acetila la lisina en posició 100 de p27 in vivo. L’acetilació de p27 afecta la seva estabilitat, afavorint-ne la seva trasnlocació del nucli al citoplasma, al inici de la fase G1, on serà degradada (Pérez-Luna et al., 2012). PCAF és un co-activador transcripcional que actúa acetilant histones, factors de trasncripció i altres proteïnes. Per altra banda, recentment s’ha descrit que p27 actúa com a regulador transcripcional, bàsicament com a repressor transcripcional de la transcripció de determinats gens diana. Així doncs, com PCAF acetila p27, en aquest treball ens hem centrat en confirmar la col·laboració de p27 i PCAF en la regulació transcripcional dels seus gens diana. Per aconseguir aquest objectiu hem identificat els programes transcripcionals regulats per p27 i PCAF en cèl·lules humanes de càncer de còlon (HCT116), mitjançant experiments de ChIP-seq. Determinem que p27 i PCAF s’uneixen a regions diferents de la cromatina en els seus gens diana. Un cop identificats els gens diana comuns de p27 i PCAF, s’ha analitzat l’expressió de 14 d’aquests gens i hem pogut concloure que p27 i PCAF en regulen la seva transcripció de forma antagònica. p27 reprimeix i PCAF activa l’expressió de la majoria dels gens diana analitzats. Aquest efecte és degut a la unió de p27 i PCAF a elements reguladors de la transcripció en la cromatina. Hem descrit que p27 s’uneix a elements amb efecte activador de la transcripció en la cromatina dels seus gens diana, inhibint-los. Per contra, PCAF s’uneix a elements amb efecte silenciador sobre la transcripció del seus gens diana. Finalment hem demostrat la interacció de p27 i PCAF amb els factors de transcripció PAX en cèl·lules HCT116.
Expressió diferencial i funció de les isoformes de l’immunoreceptor de la família SLAM CD84 en malalties autoimmunes
(Universitat de Barcelona, 2014-09-19) Díaz-Ramos, Mª Carme; Engel Rocamora, Pablo; Bastos, Ricardo; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[cat] Les malalties autoimmunes es caracteritzen per una pèrdua de la tolerància als antígens propis que dóna lloc a l'aparició de limfòcits autoreactius. La susceptibilitat genètica és un factor determinant en el desenvolupament de l'autoimmunitat i és el resultat de l’acció combinada de diversos gens. S'han identificat diferents locus de susceptibilitat i polimorfismes dels gens que contribueixen al desenvolupament de l'autoimmunitat sistèmica. Entre d'altres, s’ha trobat un locus principal de susceptibilitat al lupus eritematós sistèmic (LES) en ratolins (Sle1b) i humans (1q23) localitzat en el cromosoma 1 (Wang et al) que conté els gens de la família SLAM (Signaling Lymphocyte Activation Molecule), un grup de receptors de membrana amb importants funcions immunoreguladores. Els membres de la família SLAM han estat identificats, en els últims anys, com un grup de receptors que modulen l'activació i la diferenciació d'una àmplia gamma de tipus cel·lulars involucrats en la resposta immune innata i adaptativa. La família SLAM està constituïda per nou molècules de membrana pertanyents a la superfamília de les immunoglobulines (IgSF): SLAMF1, SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229 o LY9)), SLAMF4 (CD244 o 2B4), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (CD352 o NTB-a), SLAMF7 (CD319 o Cracco), SLAMF8 (CD353 o BLAME) i SLAMF9, que s'expressen diferencialment en les cèl·lules del sistema hematopoètic. La regió extracel·lular d'aquests receptors conté típicament un domini immunoglobulina (Ig) variable (IgV) en l'extrem N-terminal i un domini Ig constant (IgC2) a l'extrem C-terminal, excepte SLAMF3 (CD229), que està format per dos sèries de IgV / IgC2. A través d'aquests dominis estableixen interaccions específiques amb els seus lligands, la majoria dels casos de tipus homofílic, excepte la proteïna CD48 que és el receptor de CD224. Els lligands de SLAMF8 i 9 no s'han descrit fins ara. Sis dels receptors SLAM contenen un o més motius ITSM (Immunoreceptors Tyrosine-based switch motif) en la seva cua citoplasmàtica, que serveixen com a llocs d'unió per a molècules adaptadores i enzims amb dominis SH2 (Src homology 2 domains). Les molècules adaptadores SAP (SLAM-associated protein), EAT-2 (EWS / FLI activated transcript-2) i ERT (EAT-2 related Transducer) tenen una gran afinitat per aquest motiu. Estudis amb ratolins mostren l'expressió diferencial de dues isoformes de Ly108 (SLAMF6), que difereixen en la seva regió citoplasmàtica, entre ratolins normals i ratolins susceptibles al lupus. L'expressió de la isoforma Ly108-1, amb dos dominis ITSM, es troba incrementada respecte a l'altra isoforma Ly108-2, amb tres motius ITSM, a les cèl·lules B i T de ratolins susceptibles al lupus en comparació amb ratolins normals. Darrers estudis d'aquesta proteïna demostren l'existència d'una nova isoforma (Ly108-H1), absent en ratolins susceptibles al lupus i que protegeix d'aquesta malaltia als ratolins transgènics. Recentment, s’ha descrit una expressió alterada de dos receptors SLAM, CD244 i CD319, i una expressió diferencial d'isoformes d'aquestes molècules en pacients amb LES. Per tant, un concepte emergent derivat d'aquest i d'altres estudis, és que l'expressió diferencial d'isoformes dels receptors SLAM pot contribuir a la susceptibilitat a trencar l’autotolerància. Un dels membres d'aquesta família és la proteïna CD84, la qual ha estat caracteritzada i estudiada àmpliament en el nostre grup durant els últims anys. Es tracta d'una proteïna d'uns 50-80 kDa depenent del seu grau de glicosilació, amb un ectodomini format per un domini IgV en el seu extrem N-terminal al que li falta el pont disulfur; i un domini IgC2 en el seu extrem C-terminal amb dos ponts disulfur. La seva cua citoplasmàtica conté dos dominis ITSM mitjançant els quals s'uneix al domini SH2 de diferents molècules adaptadores, entre elles SAP. La interacció homofílica té lloc a través del domini IgV. RESULTATS 1. CD84 té almenys quatre ARN missatgers diferents La base de dades ECgene descriu set isoformes de la proteïna CD84. Només en quatre d'aquestes isoformes s'han localitzat seqüències d’ARN missatger i d'ESTs (Expressed Sequence Tag), que juntament amb una estructura proteica compatible, farien possible que aquestes isoformes expressessin a nivell de proteïna. Els estudis in silico realitzats van demostrar que el transcrit H1C22218.5, amb dues seqüències d'ARNm i 91 ESTs correspondria al gen íntegre o full length (CD84_FL); amb una regió codificant de 1017 pb formada per vuit exons. El transcrit H1C22218.2, amb una seqüència d'ARNm i 66 ESTs té una regió codificant de 642 pb a la qual li falten els exons 2 i 5 (CD84_Delta2, 5). En canvi el transcrit H1C22218.3, amb 5 seqüències d'ARNm i 93 ESTs està format per 984 pb i li falta l'exó 5 (CD84_Delta5). Finalment, el transcrit H1C22218.4, amb una seqüència d'ARNm i 88 ESTs està format per 816 pb i li falten els exons 5 i 6 (CD84_Delta5, 6). Estudis previs del grup van demostrar que CD84 s'expressa a nivell de proteïna en diverses línies cel·lulars del sistema immune. Per aquesta raó, i amb la intenció d'esbrinar si les isoformes descrites en les bases de dades eren presents en aquestes línies cel·lulars, es van dur a terme diferents PCR amb oligonucleòtids específics per CD84 dissenyats a les unions dels exons per aconseguir una major especificitat. La primera PCR correspon a una amplificació de la cua citoplasmàtica i dóna lloc a tres bandes de 341 pb, 308 pb i 210 pb. La seqüenciació de les bandes obtingudes demostrar que la banda de 341 pb corresponia a la proteïna íntegra (CD84_FL), mentre que la banda de 308 pb corresponia a una cua citoplasmàtica amb un exó menys, que coincidia amb les seqüències dels transcrits CD84_ Delta2, 5 i CD84_Delta5. Finalment, la banda de 272 pb amplificar una seqüència coincident amb CD84_Delta5, 6. Una segona PCR amb els oligonucleòtids dissenyats a la unió dels exons 1-3, unió present únicament en la possible isoforma CD84_ Delta2,5, va permetre diferenciar entre aquest transcrit i el CD84_Delta5. La seqüenciació de la banda obtinguda va confirmar que es corresponia amb el transcrit CD84_ Delta2,5. L'amplificació de la cua citoplasmàtica en les diferents línies cel·lulars va demostrar que almenys tres de les quatre isoformes esmentades s'expressen en diferents línies cel·lulars com cèl·lules B (Ramos, Namalwa, Raji, Daudi i Cess), cèl·lules T (Jurkat, Hsb2 i Molt4), cèl·lules mieloides (Hl60, U937, K562 i THP-1) i NK (Yt i Nkl). Les isoformes esmentades també es troben expressades en cèl·lules de sang perifèrica de voluntaris sans, en melsa i en amígdala amb una expressió de CD84_Delta5, 6 molt marcada a melsa. La PCR específica per al transcrit CD84_Delta2, 5 demostrar que aquest es troba lleugerament expressat en algunes cèl·lules T i B, però no en NK, PBMC, melsa i amígdala. 2. La isoforma CD84_Delta2, 5 no s'expressa en la membrana Diversos assajos per FACS en cèl·lules · cèl·lules COS-7 transfectades transitòriament amb la construcció pCDNA3.1 CD84_Delta2, 5 i amb l’anticòs a-CD84 2151, el qual reconeix el segon domini immunoglobulina de la proteïna, no van permetre identificar la isoforma. El marcatge intracel·lular per comprovar la presència de la isoforma al citoplasma, també va ser negatiu. Es va decidir doncs utilitzar una construcció de la isoforma que contingués el tag fluorescent GFP, per estudiar la localització de la proteïna. Es van transfectar transitòriament cèl·lules COS-7 i es va observar el resultat en el microscopi de fluorescència, indicant que la proteïna no es troba localitzada a la membrana. A causa de que el nostre interès per aquesta isoforma es centra en el possible paper funcional que podria tenir en faltar-li el domini responsable de l'adhesió, es va decidir seguir amb els assajos funcionals sense estudiar aquesta isoforma. 3. L'anticòs 688.1 contra la cua citoplasmàtica de CD84_Delta5, 6 reconeix específicament aquesta isoforma Aprofitant que la isoforma CD84_Delta5, 6 té en la seqüència de nucleòtids de la seva cua citoplasmàtica un canvi en la pauta de lectura que genera una seqüència d'aminoàcids única, es va generar un anticòs que reconegués específicament aquesta cua. La validació de l'anticòs demostrar que aquest no reconeix la resta d'isoformes de CD84 en transfectants transitoris de cèl·lules COS-7 per FACS, però sí que reconeix la isoforma d'interès. També es va demostrar que l'anticòs 688.1 immunoprecipita específicament la isoforma CD84_Delta5, 6 a transfectants transitoris de cèl·lules COS-7. La immunofluorescència en cèl·lules adherents transfectades transitòriament també mostra l’especificitat d'aquest anticòs enfront de la proteïna íntegra. 4. La isoforma CD84_Delta5, 6 s'expressa diferencialment en les línies cel·lulars testades Un cop identificades les isoformes i analitzada la seva expressió a nivell gènic, l'anticòs generat permetre analitzar l'expressió de l’isoforma CD84_Delta5, 6 a nivell de proteïna. Els estudis per FACS demostren que aquesta està present en totes les línies cel·lulars testades, i els nivells d'expressió es correlacionen amb els resultats obtinguts a nivell gènic, indicant que l'anticòs és sensible a l'expressió diferencial en cadascuna de les línies. D'aquesta manera, mentre que la proteïna CD84 total s'expressa de manera important en les línies de cèl·lules B, els nivells de isoforma CD84_Delta5,6 són baixos en aquest tipus cel·lular. En canvi, en línies de cèl·lules T, on generalment CD84 es troba expressada en un nivell més baix, la isoforma CD84_Delta5, 6 té una expressió relativa més elevada. Els nivells més alts d'expressió de la isoforma es troben en les línies de llinatge mieloide, on l'expressió de CD84 total també és alta. En el cas de les línies de cèl·lules NK gairebé la totalitat del CD84 trobat correspon a la isoforma. 5. La isoforma CD84 Delta5, 6 es detecta en les diferents subpoblacions de PBMC estudiades L'anàlisi per citometria de flux en les diferents subpoblacions de PBMC va permetre conèixer l'expressió diferencial de CD84_Delta5, 6 en individus sans. La subpoblació B1 de cèl·lules B (IgM + CD19 + CD5 +), la qual està involucrada en la immunitat humoral, té una expressió de la isoforma més elevada que la resta de cèl·lules B (IgM + CD19 + CD5-). En les cèl·lules T CD4 +, les cèl·lules memòria expressen més la proteïna total que les cèl·lules verges (CD3 + CD4 + CD45ROlow), mentre que la isoforma s'expressa de manera similar en ambdues poblacions. Pel que fa a les cèl·lules · cèl·lules T reguladores (CD4 + CD25 + FoxP3 +), tant el nivell de CD84 total com el de la isoforma és significatiu. En les cèl·lules T CD8 +, l'expressió de CD84 és considerablement més important en cèl·lules efectores memòria (CD8 + CD45RA-CCR7-) que en cèl·lules centrals memòria (CD8 + CD45RA-CCR7 +), com també ho és l'expressió de la isoforma. En canvi, les cèl·lules naïve (CD8 + CD45RA + CCR7 +), tot i tenir una expressió de CD84 total similar a les cèl·lules efectores (CD8 + CD45RA + CCR7-), tenen una expressió de CD84_Delta5, 6 més elevada que aquesta. En cèl·lules NK (CD3-CD16 + CD56 +), l'expressió de la isoforma és elevada en relació a l'expressió de CD84 total. Els monòcits tenen una expressió significativa tant de CD84 com de CD84_Delta5, 6. 6. La isoforma CD84 Delta5, 6 s'internalitza deficientment respecte la proteïna CD84 Estudis d'activació de cèl·lules Jurkat transfectades amb els ADNc de les diferents isoformes van demostrar que la isoforma CD84_Delta5, 6 té una expressió més alta després de l'activació que la resta d’isoformes. Això va fer pensar que probablement el fet de no tenir la cua citoplasmàtica amb les quatre tirosines, donaria lloc a un reciclatge deficient de la proteïna i en conseqüència, d'una acumulació en la membrana. Per demostrar si això era cert, es van fer diversos estudis d'internalització amb diferents procediments de citometria, com l’ús de l'aparell Amnis, que combina la citometria de flux amb la microscòpia de fluorescència i permet veure la localització de la proteïna marcada en una cèl·lula. El resultat obtingut va demostrar que les cèl·lules Jurkat transfectades amb la isoforma CD84_Delta5, 6 tenen una internalització més baixa que les transfectades amb CD84_FL, en condicions normals, el que incrementa amb l'activació. 7. Estudi de l'expressió de CD84 i de la isoforma CD84_Delta5, 6 a malalties autoimmunes Deu pacients de LES i dotze d'AR van participar en l'estudi de l’expressió de CD84 i de la isoforma CD84_Delta5, 6 a les diferents subpoblacions de PBMC analitzades en l'apartat 5. Els resultats obtinguts van ser comparats amb els valors d'expressió dels mateixos paràmetres de dotze voluntaris sans. D'altra banda, es comparar l'expressió de CD84 amb un altre membre de la família SLAM, NTBA, el qual ha estat assenyalat com una proteïna implicada en algunes malalties autoimmunes. En termes generals, es va veure un augment de l'expressió de CD84_Delta5, 6 a totes les subpoblacions estudiades de malalts de LES, resultat que coincideix en un estat d'activació en els estudis in vitro. En AR en canvi, els resultats assenyalen una tendència contrària en algunes subpoblacions. CONCLUSIONS Les isoformes de CD84 d'estudi han estat identificades per PCR en les línies cel·lulars d'interès. S'ha vist que aquestes isoformes es troben expressades de forma diferencial tant en les línies cel·lulars com en cultius primaris. Inicialment la isoforma CD84_Delta2, 5 ens va semblar interessant perquè en faltar el primer domini immunoglobulina, a través del qual té lloc la interacció homofílica, donaria lloc a importants deficiències en la interacció amb altres cèl·lules. Però els resultats observats mostren que la isoforma no transloca a la membrana, el que pot ser degut al fet que part del pèptid líder forma part del segon exó, absent en aquesta isoforma. La manca d'aquest fragment de pèptid líder podria fer que la proteïna no tingués la capacitat de translocar a la membrana. La isoforma CD84_Delta5, 6 té una deficient internalització causa probablement a la manca dels motius tirosina de la seva cua citoplasmàtica. La generació dels anticossos específics per a la isoforma CD84_Delta5, 6 ens va permetre estudiar l'expressió d'aquesta isoforma tant en línies cel·lulars com en les diferents subpoblacions de sang perifèrica. S'ha vist una expressió diferencial en les diferents subpoblacions estudiades, la qual cosa pot estar indicant un paper funcional important d'aquesta isoforma. Una possible explicació que es desprèn dels resultats amb pacients de LES i AR podria ser que la presència de més CD84_Delta5, 6 a la membrana fa que, encara que la proteïna no sigui funcionalment activa a nivell de senyalització intracel·lular, produeixi més adhesió i per tant afavoreixi la senyalització d'altres molècules coestimuladores, donant lloc a una hiperactivació del sistema immune. La conclusió final que es pot extreure d'aquest treball és que hi ha indicis que demostren que CD84 i els seus isoformes podrien tenir un paper important en la ruptura de la tolerància i el desenvolupament de la autoimmunitat. Les dues malalties estudiades, LES i AR, han donat resultats oposats. D'una banda, sembla ser que en el LES ha lloc una activació cel·lular. L'expressió més elevada de la isoforma en cèl·lules naïve podria indicar que CD84 és un factor de susceptibilitat al desenvolupament d'aquesta malaltia. D'altra banda, en AR no s'observa diferència d'expressió en els malalts sense tractament, mentre que el grup tractat presenta un increment de la proporció entre la proteïna total i la isoforma, suggerint que CD84 podria ser un biomarcador en el tractament de l’artritis.
Dinàmica i funcionalitat de KRas en els endosomes
(Universitat de Barcelona, 2014-09-19) Gelabert Baldrich, Mariona; Tebar Ramon, Francesc; Pol i Sorolla, Albert; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[cat] En els últims anys les endomembranes cel•lulars, especialment les del compariment endocític (endosomes primerencs, EE; tardans LI / MVBs) estan adquirint rellevància com a plataformes de senyalització que poden tenir un paper important en el control de diferents processos cel•lulars com la proliferació o la mobilitat cel•lular. S'ha descrit la presència de diverses GTPasas, entre elles KRas, en els endosomes, les quals són importants per a la senyalització cel•lular. En aquesta tesi s'ha analitzat la dinàmica i la funcionalitat de la GTPasa KRas en els endosomes. Per poder determinar la quantitat de KRas present en els endosomes i determinar si la seva activació modifica la seva proporció en aquests orgànuls, es va quantificar la presència de GFP-KRas (actiu i inactiu) en els EE. Independentment de l'estat d'activació de KRas, un 10-15% del KRas expressat es troba en els endosomes. Posteriorment, es va analitzar la dinàmica d'associació a la membrana endosomal de KRas. Es conclou que, segons l'estat d'activació que presenti la GTPasa KRas, aquesta s'uneix amb més o menys rapidesa a la membrana dels endosomes, sent més ràpida i més gran la seva recuperació a la membrana quan es troba en la seva forma activa (KRas- GTP). En aquesta tesi s'analitzen diverses proteïnes d'unió a KRas que podrien potencialment modificar la seva recuperació en la membrana dels endosomes, com la calmodulina (CaM) o la subunitat delta de la fosfodiesterasa 6 (PDEδ). Com a resultat es conclou que la CaM pot modificar la dinàmica de KRas en aquests orgànuls, segurament mitjançant la seva unió a la regió polibàsica quan la serina 181 no es troba fosforilada. Així mateix es demostra que, almenys en les nostres condicions experimentals, la PDEδ no està involucrada en la dinàmica de KRas en els endosomes. S'ha analitzat el paper de dues fosfolípids principals de la membrana dels endosomes primerencs, el PI3P i el PS (fosfatidilserina), en el reclutament de KRas a la membrana dels endosomes. Els resultats obtinguts demostren una major tendència de KRas per la unió a la PS que als PI3P, però no es descarta que, en absència de PS, KRas pugui unir-se als PI3P. En l'últim apartat d'aquesta tesi s'estudien diferents funcions de KRas en els endosomes com la seva influència en la mobilitat d'aquests orgànuls oa la mobilitat cel • lular. Es conclou que KRas és important per a la mobilitat dels endosomes i per a la mobilitat cel • lular. També s'analitza el paper de KRas en la localització de la metal•loproteasa MT1-MMP. Mitjançant tècniques bioquímiques i de microscòpia, es demostra que KRas és important, i necessari, perquè la metal•loproteasa es localitzi a la membrana plasmàtica i pugui així exercir la seva missió proteolítica per la degradació de la matriu extracel•lular.
Role of phospholipid synthesis and phospholipase C in the regulation of diacylglycerol required for membrane trafficking at the Golgi complex
(Universitat de Barcelona, 2014-02-12) Sicart Casellas, Adrià; Egea Guri, Gustavo; Sarri Plans, Elisabet; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[eng] Diacylglycerol (DAG) is required for the generation of transport carriers at the Golgi complex. Several enzymatic reactions have been found to contribute to the maintenance of DAG levels at this organelle. However, the specific metabolic pathways that, under physiological conditions, are regulated to produce the DAG required for the membrane trafficking at the Golgi complex are not known. In the first part of this work we worked on the hypothesis that phospholipid synthesis can control DAG levels at the Golgi complex for the generation of transport carriers at the Golgi complex. To study this, we altered phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylinositol synthesis for a short period of time in CHO cells to evaluate the changes in DAG and its effects in membrane trafficking at the Golgi. We found that cellular DAG rapidly increased when PC synthesis was inhibited at the non-permissive temperature for the rate-limiting step of PC synthesis in CHO-MT58 cells. DAG also increased when choline and inositol were not supplied. The major phospholipid classes and triacylglycerol remained unaltered for both experimental approaches. The analysis of Golgi ultrastructure and membrane trafficking showed that 1) the accumulation of the budding vesicular profiles induced by propanolol was prevented by inhibition of PC synthesis, 2) the density of KDEL receptor-containing punctated structures at the endoplasmic reticulum-Golgi interface correlated with the amount of DAG, and 3) the post-Golgi transport of the yellow fluorescent temperature-sensitive G protein of stomatitis virus and the secretion of a secretory form of HRP were both reduced when DAG was lowered. We confirmed that DAG-consuming reactions of lipid synthesis were present in Golgi-enriched fractions. We conclude that phospholipid synthesis pathways play a significant role to regulate the DAG required in Golgi-dependent membrane trafficking. In the second part of this work we investigate the role of phospholipase Cγ1 (PLCγ1), a DAG-producing signalling enzyme, on the membrane traffic at the Golgi complex and in the maintenance of its structure in HeLa cells. We based our work on the effects of the silencing and overexpression of PLCγ1. We found that PLCγ1 is required for post-Golgi trafficking of transmembrane and soluble proteins, that the catalytic activity of PLCγ1 is necessary to maintain the morphology of the Golgi complex, in particular the trans-Golgi compartments, and that PLCγ1 contributes to DAG homeostasis at the Golgi, measured by the localization of the DAG-sensing construct C1-PKCθ-GFP to the Golgi complex. Finally we show that cargo arrival at the Golgi complex increases the DAG production and that PLCγ1 is required for this increase of DAG localized at the Golgi. Our results show for the first time that a physiologic event along the secretory pathway, such as cargo arrival at the Golgi complex, triggers DAG production at this organelle for membrane traffic. We also provide evidence for a pivotal role of PLCγ1 at the Golgi: PLCγ1 mediates the DAG production triggered by cargo arrival and is required for the Golgi structure and membrane traffic at the trans-Golgi compartment. The main conclusions of this work are that: 1- Metabolic pathways for the synthesis of phospholipids that consume DAG regulate its levels at the Golgi complex. 2.- Phospholipid synthesis controls the levels of DAG needed for both retrograde and anterograde trafficking at the Golgi complex. 3.- Cargo arrival at the Golgi complex promotes DAG production. 4.- PLCγ1 is involved in the production of DAG triggered by cargo arrival at the Golgi complex. 5.- PLCγ1 is needed for post-Golgi transport and maintenance of the structure of the Golgi complex.
Caracterització fenotípica i funcional de membres solubles de la superfamília de receptors scavenger rics en cisteïna (SF-SRCR)
(Universitat de Barcelona, 2013-01-21) Miró Julià, Cristina; Lozano Soto, Francisco; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[cat] La superfamília de receptors scavenger rics en cisteïna (SF-SRCR) és un grup de proteïnes de membrana i/o secretades molt antic i conservat al llarg de l’evolució. Els membres de la SF-SRCR es caracteritzen per la presència d’una o més repeticions d’un domini anomenat SRCR, d’aproximadament 100 aminoàcids (aa) i ric en cisteïna. Malgrat l’alt grau de conservació del domini SRCR, no s’ha descrit una funció o lligand comú per tots els membres de la SF-SRCR. Els estudis realitzats a llarg d’aquesta tesi han permès caracteritzar molecular i funcionalment dos membres solubles relativament nous de la SF-SRCR, S5D-SRCRB (soluble 5 domains-SRCR of group B) i S4D-SRCRB (soluble 4 domains-SRCR of group B). A més, s’ha aprofundit en la descripció del paper que juga DMBT1/Hensin en la diferenciació terminal de les cèl•lules intercalades de ronyó. S5D-SRCRB és una glicoproteïna secretòria altament glicosilada, formada per cinc dominis SRCR, espaiats per pèptids rics en els aa Pro, Ser, Thr (PST), a més d’un domini C terminal de tipus mucina. Les glicosilacions que S5D-SRCRB presenta són del tipus N i O. Al seu torn, S4D-SRCRB és una glicoproteïna formada per quatre dominis SRCR també espaiats per pèptids PST, però únicament conté glicosilacions de tipus O. A més de la caracterització bioquímica dels dos membres, la generació d’anticossos monoclonals contra S5D-SRCRB va permetre estudiar el patró d’expressió tissular d’aquesta proteïna. L’estudi va desvetllar que S5D-SRCRB s’expressava principalment als epitelis, on el tracte urogenital presentava els nivells d’expressió més importants a nivell protèic i d’ARN. Pel que fa la funció de S5D-SRCRB i S4D-SRCRB, es va observar que ambdues proteïnes s’unien de manera dosi-depenent a proteïnes de la matriu extracel•lular (fibronectina i laminina). S5D-SRCRB, a més, interaccionava amb galectina-1 i galectina-3, mitjançant els seus dominis d’unió a lectines. D’altra banda, S5D-SRCRB i S4D-SRCRB interactuaven amb components de la paret bacteriana (peptidoglicà i lipopolisacàrids) i fúngica (glucans lineals), actuant com a reconeixedors dels patrons moleculars associats a patògens (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Les dues proteïnes eren també capaces d’agregar cultius bacterians (E. coli i S. aureus) i fúngics (C. albicans). Per tant, S5D- i S4D-SRCRB podien actuar com a receptors duals capaços de reconèixer estructures endògens i exògenes, i participar en el manteniment de la homeòstasi de l’organisme. La possibilitat que S5D-SRCRB jugués un paper en la defensa dels epitelis contra infeccions es va estudiar amb més detall en el tracte urogenital, emprant models in vitro i in vivo. Els resultats van revelar que l’expressió de S5D-SRCRB augmentava tant en cultius de la línia cel•lular clone C tipus ß expossats a components de la paret bacteriana, com en els ronyons de ratolins a un model d’infecció en el tracte urinari (urinary tract infection, UTI). El patró d’expressió de S5D-SRCRB també canviava durant el procés de diferenciació terminal de les cèl•lules intercalades de ronyó, i durant l’espermatogènesi en els túbuls seminífres. Per aquest motiu s’ha proposat que S5D-SRCRB pot jugar un paper en la diferènciació cel•lular, com s’ha demostrat que passa en el cas de DMBT1/Hensin. La secreció de DMBT1/Hensin és clau en el procés de diferenciació terminal que pateixen les cèl•lules intercalades en condicions d’acidosi, i pel qual passen d’expressar un fenotip de cèl•lula intercalada tipus ß a un de tipus α.
Función de la fosfatasa de fosfolípidos 3 (LPP3) en las etapas tempranas de la vía secretora
(Universitat de Barcelona, 2013-10-29) Gutiérrez Martínez, Enric; Egea Guri, Gustavo; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[spa] El complejo de Golgi participa en el procesamiento, la distribución y el transporte de lípidos y proteínas hacia su destino final dentro de la célula. El transporte desde el Golgi está mediado por intermediarios de transporte (ITs), principalmente vesículas y túbulos. La formación de ITs se inicia con la gemación de la vesícula o el túbulo, a continuación se produce su elongación y finalmente tiene lugar su fisión. Este proceso requiere de una compleja maquinaria molecular en la que intervienen las llamadas proteínas de cubierta, proteínas motoras asociadas al citoesqueleto, y los lípidos de las membranas. Respecto al papel de los lípidos, éstos pueden actuar tanto en el reclutamiento de proteínas citosólicas que participan en la formación de los ITs, como dotando a la membrana de las propiedades físicas óptimas para su deformación en vesículas o túbulos. La curvatura de membrana está facilitada por lípidos con estructura cónica como el ácido lisofosfatídico (LPA), el ácido fosfatídico (PA) y el diacilglicerol (DAG). El DAG cumple una doble función en la formación de ITs desde el Golgi: por una parte actúa en el reclutamiento y la activación de la proteína cinasa D (PKD), necesaria para la correcta fisión de vesículas desde la red trans-Golgi (TGN). Por otra parte ayuda a la formación de curvatura negativa. El DAG en el Golgi está estrechamente regulado por diferentes vías que controlan su formación y metabolismo. Una de estas vías está mediada por las llamadas fosfatasas del ácido fosfatídico (PAPs), que producen DAG a partir de defosforilar el PA. Existen dos familias de proteínas que actúan como fosfatasas del ácido fosfatídico. Las enzimas de la familia PAP1son citosólicas, su actividad catalítica es dependiente de Mg+2, se inhiben por N-etilmaleimida (NSF) y el PA es su único sustrato. Las enzimas PAP2 son proteínas transmembrana, independientes de Mg+2 e insensibles a NSF. Las PAP2 también se conocen como fosfatasas de lípidos fosfato (LPPs), ya que además del PA pueden también catalizar la defosforilación de otros lípidos como la ceramida-1-fosfato (C1P), la esfingosina-1-fosfato (S1P) y el ácido lisofosfatídico (LPA), aunque con diferentes afinidades (PA ~ LPA > C1P > S1P). La inhibición de las PAP por el agente farmacológico propanolol, indica que el DAG que proviene de esta vía es necesario para la formación de ITs desde el Golgi al retículo endoplasmático (RE). En esta tesis hemos demostrado que uno de los miembros de la familia PAP2, la enzima PAP2b, también conocida como LPP3, se localiza en diferentes compartimentos de la vía secretora, desde los sitios de salida del RE (ERES) hasta el complejo de Golgi. El silenciamiento de LPP3: (i) reduce la formación de túbulos desde el compartimento intermedio entre el RE y el Golgi (ERGIC) y el complejo de Golgi, y a su vez incrementa la longitud de aquéllos túbulos formados desde el Golgi; (ii) causa un retraso en el transporte dependiente de Rab6 de la subunidad B de la toxina Shiga desde el Golgi al RE, sin afectar al transporte anterógrado de RE a Golgi; y (iii) a nivel ultraestructural incrementa el número de perfiles vesiculares asociados a las cisternas del Golgi. El silenciamiento de la LPP3 también reduce la síntesis de novo de DAG y los niveles de DAG en el Golgi. Además, también hemos demostrado que la sobreexpresión de un mutante catalíticamente inactivo de la LPP3 reproduce los efectos observados tanto con el silenciamiento de la LPP3, como al inhibir la actividad catalítica de las PAP2 por el propanolol. De forma conjunta, nuestros resultados demuestran que la LPP3, a partir de regular la homeostasis de DAG, participa en la formación de ITs en diferentes compartimentos de la vía secretora, regulando el transporte retrógrado entre el RE y el Golgi.
Identificación de las estructuras corticales implicadas en la generación de la actividad epiléptica crítica e intercrítica en pacientes con epilepsia fármacorresistente: un estudio de resonancia magnética funcional con EEG simultáneo.
(Universitat de Barcelona, 2013-11-08) Donaire Pedraza, Antonio Jesús; Bargalló Alabart, Núria; Carreño, Mar; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[spa]A pesar del extenso conocimiento de la epilepsia de que disponemos hoy día, todavía permanece como materia de estudio la localización exacta de los generadores corticales de la actividad epiléptica crítica e intercrítica; así como, de las vías y estructuras cerebrales implicadas en la propagación de las crisis epilépticas. Estos conceptos resultan de vital importancia para poder profundizar en la fisiopatología de la epilepsia, y son esenciales a la hora de la planificación de la cirugía funcional de la epilepsia. Esta tesis consta de tres estudios dónde se desarrolla un nuevo método de análisis de las imágenes de RMf-EEG que permite secuenciar en el tiempo los cambios de señal BOLD relacionados con la actividad ictal e interictal, y, de esta manera, poder indagar en el correlato hemodinámico y metabólico de esta actividad con una resolución temporal y espacial más alta que con los métodos de análisis tradicionales. El hecho de poder acceder a la secuencia de activación de las diferentes estructuras cerebrales implicadas en la generación y propagación de la actividad crítica e intercrítica nos podría proporciona información precisa sobre la localización de los sustratos corticales implicados en su génesis, así como, sobre los fenómenos dinámicos que acontecen durante su evolución y desarrollo.
Characterization of mechanisms underlying neuronal survival and plasticity in Huntington's disease
(Universitat de Barcelona, 2013-07-22) Anglada Huguet, Marta; Alberch i Vié, Jordi, 1959-; Xifró i Collsamata, Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular, Immunologia i Neurociències
[cat] Huntington’s disease is a progressive neurodegenerative disorder caused by the expansion of a CAG tract in the exon-1 of the huntingtin gene. Mutant huntingtin induces a large amount of toxic effects that trigger cell dysfunction and consequently, behavioral alterations such as motor dysfunction, cognitive decline and psychological disturbances. However, before the onset of symptoms individuals are healthy. Thus, it is plausible that compensatory mechanisms may be activated to regulate a … [+] Resum: La malaltia de Huntington és un trastorn neurodegeneratiu progressiu caracteritzat per la presencia d’alteracions motores i dèficits cognitius. Aquesta malaltia està causada per l’expansió anòmala del triplet CAG en l’exó 1 del gen que codifica per la proteïna huntingtina. La huntingtina mutada indueix gran quantitat d’efectes tòxics que desencadenen la disfunció cel•lular i, en conseqüència, les alteracions en la conducta característiques d’aquesta malaltia. Tot i així, abans de l’aparició del símptomes, els individus són sans. Per tant, és plausible pensar que es produeix una activació de mecanismes compensatoris per a regular l’equilibri entre la mort i la supervivència cel•lular. En aquesta tesis, ens hem centrat en dos objectius principals: (1) l’estudi dels mecanismes compensatoris activats en la presencia de la huntingtina mutada per tal de millorar la supervivència cel•lular i (2) la identificació de dianes moleculars per a reduir els dèficits motors i cognitius, així com per a millorar la plasticitat sinàptica en models murins de la malaltia de Huntington. Específicament, els nostres resultats han ajudat a entendre el paper de la proteïna cinasa p90Rsk i del factor de transcripció Elk-1 en la susceptibilitat de les neurones estriatals a la mort induïda per la huntingtina mutada. Per altre banda, mostrem per primera vegada el potencial terapèutic dels receptors de la prostaglandina E2, EP1 i Ep2, per al tractament dels símptomes clínics y histopatològics en la malaltia de Huntington.

Examinar

Enviaments recents