Tesis Doctorals - Departament - Biologia Cel·lular

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Funciones de las proteínas asociadas a mielina durante el desarrollo del sistema nervioso central y en neurodegeneración
(Universitat de Barcelona, 2010-02-23) Gil Fernández, Vanessa; Río Fernández, José Antonio del; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] El potencial regenerativo del sistema nervioso central (SNC), a diferencia del sistema nervioso periférico (SNP), desaparece gradualmente conforme avanza el desarrollo, coincidiendo con el inicio de la mielinización. Hasta el momento, se ha descrito la existencia de tres proteínas asociadas a la mielina (MAIPs) que estarían implicadas en este proceso. Estas proteínas, Nogo-A, MAG y OMgp, se unen, de forma independiente, a un complejo receptor neuronal común formado por NgR1, p75 o TAJ-1/TROY y Lingo-1, y la activación de este complejo receptor desencadena una señalización intracelular que causa la pérdida de plasticidad en el SNC adulto y la inhibición de la regeneración axonal tras lesión. Sin embargo, los estudios publicados en el momento de iniciarse el presente trabajo sugerían que, tanto los ligandos como los componentes del complejo receptor, podrían ejercer otras funciones no relacionadas con la inhibición de la regeneración axonal en el adulto. Además, aunque se acababa de describir que Lingo-1 era miembro esencial del complejo receptor para las MAIPs, no se había demostrado si los tres componentes propuestos para formar el complejo receptor compartían el mismo patrón de expresión, ni tampoco si podían coexistir en el mismo tipo celular y compartimento. Por ello, nos propusimos analizar en detalle el patrón de expresión de Lingo-1 y de su distribución celular en relación al resto de componentes del complejo. Nuestros resultados muestran la coexistencia de Lingo-1, NgR1, p75 y TROY en el cerebro de ratón durante una ventana temporal postnatal muy definida. También hemos determinado la distribución de Lingo-1 en determinadas subpoblaciones neuronales. Sorprendentemente, Lingo-1 se expresa en estadios tempranos del desarrollo en los cuales no se expresa NgR1. Finalmente, mostramos que el dominio intracelular de Lingo-1 contribuye a la señalización y además interacciona con la proteína postmitótica neuronal Myt1l, sugiriendo que Lingo-1 puede regular la actividad de este factor de transcripción al afectar a su localización subcelular. Por otra parte, existían ciertas discrepancias en cuanto al tipo celular en el que se expresaba OMgp. Mientras algunos estudios sostenían una localización exclusiva en oligodendrocitos, otros proponían una expresión neuronal. Además, todos los estudios de expresión descritos hasta la fecha se centraban en estadios postnatales y adultos, pero no en estadios embrionarios. Así, uno de nuestros objetivos fue profundizar en la distribución celular y regional de las proteínas OMgp a lo largo del desarrollo del telencéfalo de ratón y determinar posibles funciones adicionales. Observamos que, a nivel celular, OMgp se localiza en membranas neuronales de dendritas y axones y también en fracciones sinaptosomales de cerebro y en estructuras similares a botones sinápticos. Además, la aparición de la inmunoreactividad en la corteza durante el desarrollo coincide con el establecimiento de la conexión tálamo-cortical y, por tanto, de la formación de los barriles (barrel-field) de la corteza. El análisis del barrel-field en ratones deficientes en OMgp revela que, aunque la conexión tálamo-cortical está formada, el destino final de numerosos axones talámicos está alterado ya que invaden ectópicamente las capas II-III de corteza en lugar de capa IV. Por último, algunos estudios habían descrito la implicación de algunas proteínas de la mielina, como Nogo-A, en diversas enfermedades neurodegenerativas como epilepsia del lóbulo temporal, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica y esquizofrenia. Estas evidencias llevaron a plantearnos la posibilidad de que la expresión de Nogo-A pudiera estar alterada en la enfermedad de Alzheimer (AD), situación patológica en la cual ocurre una gran pérdida celular y una significante reorganización sináptica en áreas relacionadas con el aprendizaje y la memoria. Por ello, nos propusimos analizar la expresión de Nogo-A en la formación hipocámpica humana en una situación de envejecimiento normal y en una situación de AD. Nuestros resultados indican que en AD, Nogo-A es sobreexpresado por neuronas hipocámpicas y aparece asociado a depósitos amiloideos en placas seniles. Estos resultados refuerzan la idea de que la expresión temprana de OMgp y Lingo-1 juega un importante papel durante el desarrollo y apuntan una participación de OMgp en el establecimiento de la conexión tálamo-cortical. Además, sugieren una posible participación de las proteínas asociadas a mielina, así como de los componentes del complejo receptor, en las respuestas asociadas al envejecimiento y en particular a enfermedades neurodegenerativas como AD.
Papel regulador de la proteína priónica celular en la enfermedad de Alzheimer y uso de gamma-péptidos como potenciales agentes terapéuticos
(Universitat de Barcelona, 2015-04-21) Vergara Paños, Cristina; Río Fernández, José Antonio del; Gavín Marín, Rosalina; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más común de demencia. Afecta, actualmente, a más de 30 millones de personas en todo el mundo, causando un gran impacto socioeconómico que aumenta año tras año con unos 7,7 millones de nuevos casos por año. La enfermedad de caracteriza por un deterioro cognitivo y cambios conductuales. A nivel patofisiológico se caracteriza por la acumulación del péptido beta-amiloide (Aß), y la proteína tau. La proteína tau es una proteína que se une a tubulina, estabilizando los microtúbulos y ayudando a su polimerización. En la enfermedad, la proteína se hiperfosforila, desestabilizando los microtúbulos por un lado, y auto-agregándose para formar filamentos helicoidales pareados y finalmente los ovillos neurofibrilares. La proteína precursora amiloide (APP), en la enfermedad, es procesada por beta- y gamma-secretasas, resultando en la formación del péptido beta-amiloide, en la vía amiloidogénica. Este péptido agrega dando lugar a las placas amiloides. Se ha descrito que los oligómeros, un estadio de agregación intermedio, son las formas más tóxicas, y que PrPC, que sea demostrado que se une con elevada afinidad a los oligómeros de Aß, podría ser un receptor y mediador de la toxicidad causada por éstos. PrPC es conocida por su participación en las enfermedades espongiformes transmisibles (EETs), en su forma patogénica llamada PrPSc, que se acumula en el cerebro formando agregados, aunque también se han encontrado agregados amiloides en estas enfermedades y una disminución de los niveles de PrPC. Esta proteína participa en procesos como la neuritogénesis o la transmisión sináptica, y hay evidencias de que podría tener una función neuroprotectora en el cerebro. Esta tesis doctoral aborda la participación de PrPC en la EA, des de diferentes puntos de vista, tanto en la acumulación del péptido Aß, como en la fosforilación de tau. Nuestros datos apuntan a una posible función neuroprotectora por parte de PrPC. Por un lado, hemos observado que PrPC podría regular la fosforilación de tau modulando los niveles de expresión de ésta, que se produce debido a los oligómeros de Aß, de forma específica, y no por los agregados insolubles y fibrilares. También hemos visto que, una sobreexpresión de PrPC correlaciona tanto con un aumento de la fosforilación de tau como con un aumento del depósito de Aß, apuntando a una posible pérdida de esta función neuroprotectora. También hemos estudiado la relación entre el péptido Aß y PrPC desde la perspectiva de las enfermedades espongiformes. Hay evidencias de PrPC regula los niveles de Aß en la EA, y debido a la presencia de agregados amiloides, y a una disminución de los niveles de PrPC en las EETs, nos planteamos el papel del depósito de Aß en la infectividad del prión. Nuestros resultados apuntan a que estos depósitos no afectan a la infectividad. Por último, a nivel terapéutico, existen tratamientos paliativos para la EA enfocados en compensar el desequilibrio en diferentes neurotransmisores como la acetilcolina o el glutamato. Estos tratamientos no consiguen frenar el avance de la enfermedad. Aunque muchas alternativas de diferentes clases están ahora en diferentes fases clínicas, algunas de ellas han presentado efectos secundarios como meningoencefalitis, y otras no han conseguido mejorar los síntomas en pacientes respecto a grupos control con placebo. Esta tesis aborda una posible alternativa a los tratamientos anti-amiloides actuales. A partir del screening de una librería de gamma-péptidos derivados de prolina, hemos identificado un candidato con propiedades relacionadas con la neuritogénesis, y una disminución de los niveles de Aß, por la modulación de la beta-secretasa BACE1.
Estudi de la contribució de CenH3ClD en la funció centromèrica. Identificació i anàlisi funcional de noves proteïnes centromèriques a Drosophila
(Universitat de Barcelona, 2015-01-14) Medina Giró, Sonia; Azorín, F.; Soriano García, Eduardo; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[cat] El centròmer és l’estructura cromosòmica implicada en la correcta segregació de la informació genètica durant els processos de meiosi i mitosi. La funció centromèrica està determinada epigenèticament per la presència de la variant centromèrica de la histona H3 (CenH3). Aquesta variant substitueix a la histona H3 canònica en els nucleosomes de tots els centròmers funcionals, sent fonamental la seva localització pel correcte assemblatge del cinetocor. En cèl·lules de vertebrats, els nucleosomes de CenH3 actuen com la plataforma necessària pel reclutament de les proteïnes centromèriques que formen el CCAN (Constitutive centromere-associated network). En cada mitosi, les proteïnes del CCAN recluten els components de la xarxa KMN per formar un cinetocor funcional. Mentre que per algunes espècies s’han identificat algunes de les proteïnes homòlogues a les del CCAN, en el cas de D. melanogaster es desconeixen totes, a excepció de CENP-C. En aquest treball per tal d’identificar i caracteritzar noves proteïnes centromèriques a Drosophila s’ha realitzat la purificació i identificació de les proteïnes associades als nucleosomes de CenH3 de Drosophila, CenH3CID. Entre altres, hem identificat la proteïna Barrier-to-autointegration factor (BAF). Aquesta proteïna està conservada i té un paper clau en el reassemblatge de la membrana nuclear un cop finalitzada la mitosi. Hem observat que dBAF es localitza en la heterocromatina de les cèl·lules SL2 en interfase però, un cop iniciada la mitosi aquesta es localitza exclusivament en els centròmers dels cromosomes metafàsics. A més, hem detectat que dBAF intervé en la deposició i/o estabilització de CENP-C en els centròmers, ja que la sobreexpressió del dominant negatiu dBAF-YFP o la depleció de dBAF afecten els nivells centromèrics de CENP-C. CENP-C interacciona amb dBAF, i aquesta interacció depèn de l’estat de fosforilació de dBAF i de RNA. En les nostres purificacions també s’ha identificat la proteïna codificada pel gen CG8289. Els nostres assajos d’immunolocalització a cèl·lules SL2, neuroblastos i a cromosomes politènics confirmen que la proteïna codificada pel gen CG8289 és un nou factor de la heterocromatina pericentromèrica de D. melanogaster. Per altra banda, també hem analitzat la contribució del domini N-terminal de CenH3CID (N-CenH3CID) en l’assemblatge del cinetocor. Concretament, hem observat que el reclutament ectòpic de N-CenH3CID davant d’un gen reporter indueix el silenciament d’aquest gen degut al reclutament de BubR1, una proteïna del cinetocor que està relacionada amb el punt de control de la mitosi. Aquest efecte depèn d’un domini del N-CenH3CID conservat entre les diferents espècies del grup de Drosophila i ric en arginines. Els nostres resultats mostren que aquestes arginines són necessàries per produir el silenciament, ja que la seva deleció o mutació per alanines elimina pràcticament el silenciament del gen reporter. A més, el reclutament dels dominis N-terminals de CenH3s de S. cerevisiae i de humans també indueixen el silenciament del gen reporter, indicant que malgrat el baix grau de conservació d’aquest domini entre espècies, la contribució de CenH3 en el reclutament de proteïnes del cinetocor està evolutivament conservada. Per últim, s’ha confirmat la contribució de la proteïna F-box Ppa en l’estabilitat de CenH3CID. Ppa reconeix específicament el domini CATD de CenH3CID, induint la poliubiquitinació i posterior degradació d’aquesta variant via proteosoma.
Implicació de la via de senyalització de la Reelina en els trastorns psiquiàtrics i la neurogènesi adulta
(Universitat de Barcelona, 2014-11-07) Masachs Janoher, Núria; Soriano García, Eduardo; Teixeira, Catia Marlene; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[cat]Els trastorns mentals com l’esquizofrènia o els trastorns de l’humor i l’ansietat són unes patologies amb un gran impacte i una alta prevalença en la nostra societat. Una de les característiques d’aquestes patologies són els problemes de plasticitat sinàptica, com per exemple, la neurogènesi del gir dentat, que a més s’ha relacionat amb problemes cognitius i també amb patologies psiquiàtriques. En els darrers anys s’ha suggerit que la desregulació de processos del desenvolupament neuronal, ja sigui per alteracions genètiques o factors ambientals, poden ser la clau per explicar l’etiologia d’aquestes malalties. La Reelina és una proteïna de matriu extracel·lular essencial pel desenvolupament neuronal, a més de regular processos de plasticitat sinàptica i transmissió glutamatèrgica, tant en el cervell en desenvolupament com a l’adult, a més d’estar disminuïda en patologies com l’esquizofrènia o els trastorns de l’humor, tot i que el paper que aquesta hi juga encara no està descrit. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat investigar el paper de la Reelina en les malalties psiquiàtriques, tant el possible paper en l’etiologia com en la protecció d’aquestes malalties, a més d’investigar si tenia un paper en la correcta generació de noves neurones. Per tal de portar a terme aquest objectiu, vam utilitzar un ratolí que sobreexpressa Reelina al cervell anterior adult i el vam sotmetre a una bateria de testos de comportament per modelar aspectes de malalties psiquiàtriques com el cap obert, la caixa blanca i negra, el test de natació forçada després d’un tractament crònic de corticosterona, la sensibilització a la cocaïna o dèficits en la inhibició per pre-pols induïda per l’administració d’antagonistes dels receptors N- metil-D-aspartat (NMDAR). Amb aquests testos vam comprovar que la sobreexpressió de Reelina protegia de l’aparició de comportaments esquizofrènics i depressius i que aquesta resiliència es produïa per un una disminució de la transmissió glutamatèrgica a través de la subunitat NR2B dels receptors NMDA. A més de demostrar-ne un paper protector, amb la utilització d’un ratolí transgènic floxed dab1 hem comprovat que una disminució transitòria durant el desenvolupament de l’efector intracel·lular de la via de senyalització de la Reelina, Dab1, provoca alteracions permanents en la laminació del còrtex i hipocamp. A més, la regulació transitòria a la baixa durant el desenvolupament d’aquesta via provoca alteracions de comportament en els ratolins adults com dèficits de memòria, cura maternal, inhibició per pre-pols o sensibilització a la cocaïna, i que alguns d’aquests dèficits ja estaven presents durant l’adolescència. A més, hem pogut rescatar els dèficits cognitius amb un potenciador de la neurotransmissió glutamatèrgica com és la D-cicloserina. Per acabar, vam voler comprovar si un procés de plasticitat alterat en patologies psiquiàtriques com la neurogènesi adulta estava regulat pels nivells de Reelina. Amb la utilització del marcatge específic de les noves neurones mitjançant retrovirus, vam poder veure que la Reelina també controla aquest procés. Hem vist que la via de senyalització és essencial pel correcte desenvolupament, ja que la manca de senyalització d’aquesta via provoca la formació de neurones aberrants, molt menys complexes i amb una gran quantitat de dendrites basals pròpies de processos patològics, i tot i aquesta morfologia alterada, aquestes neurones aconseguien integrar-se en el circuit. A més, hem comprovat que un augment dels nivells de Reelina provoca l’acceleració del procés de maduració. En resum, hem vist que la Reelina té un paper essencial en la protecció envers el desenvolupament de malalties psiquiàtriques, ja que mentre la falta de senyal provoca l’aparició de fenotips, l’augment en provoca la resistència. A més, hem comprovat que un procés alterat en aquestes patologies com és la neurogènesi adulta, també està regulat per la Reelina.
Regulación de la dinámica mitocondrial en neuronas sometidas a excitotoxicidad
(Universitat de Barcelona, 2014-12-04) Martorell Riera, Alejandro; Soriano Zaragoza, Francesc X. (Francesc Xavier); Reina del Pozo, Manuel; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] Durante el ictus, los niveles elevados de glutamato extracelular, el principal neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central, aumentan y se unen al receptor de NMDA promoviendo la excitotoxicidad. Esta situación genera que un flujo excesivo de Ca2+ pase a través del receptor de NMDA aumentando sus concentraciones intracelulares activando toda una serie de cascadas de señalización que pueden actuar directamente sobre las mitocondrias, promoviendo varios programas de muerte celular. Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos que constantemente se fusionan y dividen, cambiando de forma y localización. El equilibrio entre la fisión y la fusión es importante para la función mitocondrial y es un regulador clave de la progresión de la muerte celular. Las proteínas que conforman el proceso de fusión mitocondrial y de fisión están formadas por un grupo de GTPasas. La fusión de la membrana mitocondrial interna está mediada por OPA1. Dos mitofusinas (Mfn1 y 2) median la fusión de la membrana externa mitocondrial. Por otro lado, la fisión mitocondrial está mediada por Drp1, una proteína citoplasmática que es reclutada a la superficie mitocondrial después de ser modificada a nivel post-traduccional. Los problemas relacionados con la dinámica mitocondrial se han descrito en múltiples enfermedades neurodegenrativas así como también en cáncer y sida. En esta Tesis hemos demostrado que Mfn2 juega un papel muy importante en el mantenimiento de la funcionalidad mitocondrial y la supervivencia neuronal. En excitotoxicidad es la única proteína de la maquinaria de fusión/fisión que disminuye su expresión en dos modelos in vitro distintos y también en un modelo in vivo. Hemos identificado dos fases de fragmentación mitocondrial en excitotoxicidad. La primera y que cursa en poco tiempo depende de la activación y reclutamiento de Drp1 mientras que la fase tardana que se inicia 4 horas después del insulto, parece depender de la reducción de los niveles proteicos de Mfn2. Esta fase tardía es irreversible y parece condenar a la neurona. La disminución de Mfn2 genera alteraciones en la homeóstasis del Ca2+, disminuye el potencial de membrana mitocondrial, empeora la comunicación entre las mitocondrias y el retículo endoplasmático, aumenta la traslocación de Bax a las mitocondrias y favorece la liberación del citocromo c. Hemos encontrado que la reducción en la expresión de Mfn2 durante la excitotoxicidad se da a nivel transcripcional y depende del factor de transcripción MEF2 que regula a Mfn2 a nivel basal en neuronas. En excitotoxicidad, MEF2 es degradado y causa la disminución de Mfn2. Este contexto hace pensar que Mfn2 podría ser una diana a tener en cuenta para futuros desarrollos de drogas y poder, de este modo, incrementar la pequeña ventana terapéutica que existe actualmente para el ictus.
Papel de las proteínas SNARE en guía axonal y progresión tumoral
(Universitat de Barcelona, 2014-12-18) Barrecheguren Manero, Pablo José; Ulloa Darquea, Fausto Alexander; Araújo, Sofia J.; Soriano García, Eduardo; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] El tráfico de membrana en el cono crecimiento axonal es clave durante el desarrollo del sistema nervioso. La familia de proteínas SNARE son una familia de moléculas cuya función principal es mediar la fusión entre membranas. Este hecho hace que las proteínas SNARE tengan potencialmente tengan un papel en el desarrollo axonal y otros procesos que impliquen una gran actividad en los procesos de tráfico de membrana: un ejemplo de casos como así es la progresión de tumores con un alto grado de recambio de membrana como el glioblastoma, que es el caso más común y mortal de astrocitoma de grado IV. Las proteínas SNAREs se clasifican en dos grupos t-SNARE (localizadas en las membranas objetivo) y v-SNARE (localizadas en las membranas vesiculares) y juntas median la fusión entre membranas a través de la formación del complejo SNARE. El complejo SNARE mejor caracterizado es el tetrámero formado por Sintaxina1 (Stx1), dos SNAP-25 y VAMP2. En esta tesis doctoral estudiamos en primer lugar el papel de las proteínas SNARE en los procesos de guía axonal. Para ello utilizamos como modelo el desarrollo del sistema nervioso embrionario en Drosophila melanogaster y obtuvimos como resultado que problemas en las proteínas SNARE, especialmente en Sintaxina1A (Syx1A), generan problemas de guía axonal en el sistema nervioso. Si nos centramos en los estudios del desarrollo del sistema nervioso en mutantes nulos para Syx1A, todas las estructuras nerviosas desde el sistema nervioso central, los nervios motores y el sistema periférico desarrollaron problemas de guía axonal. Además, estudios de interacción génica y una detalla caracterización del fenotipo sugieren que la alteración de las proteínas SNARE, especialmente Syx1A, genera problemas en la vía de guía axonal Slit/Robo. En segundo lugar, estudiamos el rol de las proteínas SNARE en la progresión tumoral. Pare ello analizamos los efectos in vitro e in vivo que tiene el bloqueo de la función de Stx1 en líneas celulares y modelos murínicos del glioblastoma Como resultado, detectamos una pérdida de la proliferación in vitro e in vivo al bloquear Stx1. Además, el bloqueo de Stx1 disminuye la capacidad invasiva in vitro de las células de glioblastoma.
Role of Reelin in synaptogenesis and synaptic stabilization in the adult brain
(Universitat de Barcelona, 2014-09-25) Bosch Piñol, Carles; Martínez García, Albert; Soriano García, Eduardo; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[eng] Reelin is a high molecular weight extracellular glycoprotein that exhibits key roles both in the development of the central nervous system and in adult synaptic plasticity. Reelin expression during brain development is driven by cortical Cajal-Retzius (CR) cells (Alcantara et al., 1998). The secretion of Reelin by these cells ensures a correct splitting of the preplate into marginal zone and subplate (Del Rio et al., 1997; Super et al., 1998). Further, Reelin regulates the inside-out patterning formation of the layered cortical structures (Tissir and Goffinet, 2003). Constitutive Reelin deficit in reel ermice (Goffinet and Dernoncourt, 1991)generate an abnormally layered brain with a highly reduced cerebellum concomitant with numerous cellular ectopia(D'Arcangelo and Curran, 1998). The expression of Reelin undergoes an important change after completion of the neuronal migration processes (Alcantara et al., 1998; Soriano and Del Rio, 2005; Herz and Chen, 2006). This early suggested the existence of a new function for Reelin in the postnatal and adult brain. Heterozygous reeler(HRM)and reeler-like mice presented reduced amounts of Reelin signaling (Liu et al., 2001; Badea et al., 2007; Katsuyama and Terashima, 2009)as well as deficits in synaptic plasticity-related events, such as impairments in long-term potentiation(LTP) paradigms (Weeber et al., 2002; Beffert et al., 2005), altered phosphorylation and composition of NMDA receptors (Chen et al., 2002; Groc et al., 2007), and altered AMPA receptor-mediated responses (Qiu et al., 2006). Further, alterations in spine density were found on HRM and reeler mice (Niu et al., 2008), and adult conditional depletion of Dab1 triggers changes in their morphology (Trotter et al., 2011). More interestingly, Reelin supplementation reverts many of these phenotypes (Qiu and Weeber, 2007; Hellwig et al., 2011; Rogers et al., 2013) and adult Reelin over expression in vivo promotes enhanced LTP (Pujadas et al., 2010). Last, Reelin expression abnormalities have been reported in patients for various psychiatric disorders (Knuesel, 2010; Folsom and Fatemi, 2013).Moreover, it has been related to Alzheimer’s disease(AD) (Knuesel, 2010) and its overexpression in mouse models for ADrevealed delayed progression of the appearance of pathological insults (Pujadas et al., 2014). Here we used transgenic mice overexpressing Reelin (Pujadas et al., 2010)as well as approaches involvingconditional depletion of Dab1 in adult mice (Pramatarova et al., 2008; Teixeira et al., 2014)and in new-born granule cellsof the DG (Teixeira et al., 2012) to study the role of Reelin in the establishment and stabilization of synapses in the adult brain. In the first chapter, we analyze the role of Reelin in the molecular features and ultrastructureof the presynaptic terminals in the adult hippocampus of Reelin overexpressing (Reelin-OE) mice. We report an enhanced complexity of hippocampal boutons. In the second chapter, we analyze the role of Reelin in the molecular composition and ultrastructure of the hippocampal dendritic spines of Reelin-OE mice. We report spine hypertrophy, spine apparatus enlargement and redistribution of NMDA receptor subunits and p-cofilin. In the third chapter, we analyze the effects of Reelin signaling up-and downregulationin spine presence and morphology along two types of pyramidal cells, CA1 and S1BF layer 5. We show that Reelin regulates spine plasticity, but that the precise effects are cell-dependent and dendritic domain-specific. In the fourth chapter, we present a new approach for correlative optical microscopy (OM) –focused ion beam / scanning electron microscopy (FIB/SEM) imaging of pre-labeled dendritic segments with diaminobenzidine (DAB). We applied this method to study the synaptic integration into the preexisting circuitryof new-born DG granule cells (GCs). We report that these cells exhibit branched spines, that morphometrical parameters of a spine and synapse correlate and that spine morphologyand presynaptic innervation changes with cell development. Finally, in the fifth chapter we analyze the effects of Reelin signaling up-and down regulationin integration of new-born DG GCsinto the preexisting circuitry. We describe changes in the size and morphology of these spinesand synapses, as well as in their connectivity. 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Pujadas L, Gruart A, Bosch C, Delgado L, Teixeira CM, Rossi D, de Lecea L, Martinez A, Delgado-Garcia JM, Soriano E (2010) Reelin regulates postnatal neurogenesis and enhances spine hypertrophy and long-term potentiation. J Neurosci 30:4636-4649. Pujadas L, Rossi D, Andres R, Teixeira CM, Serra-Vidal B, Parcerisas A, Maldonado R, Giralt E, Carulla N, Soriano E (2014) Reelin delays amyloid-beta fibril formation and rescues cognitive deficits in a model of Alzheimer's disease. Nat Commun 5:3443. Qiu S, WeeberEJ (2007) Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol 97:2312-2321. Qiu S, Zhao LF, Korwek KM, Weeber EJ (2006) Differential reelin-induced enhancement of NMDA and AMPA receptor activity in the adult hippocampus. J Neurosci 26:12943-12955. 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Teixeira CM, Kron MM, Masachs N, Zhang H, Lagace DC, Martinez A, Reillo I, Duan X, Bosch C, Pujadas L, Brunso L, Song H, Eisch AJ, Borrell V, Howell BW, Parent JM, Soriano E (2012) Cell-autonomous inactivation of the reelin pathway impairs adult neurogenesis in the hippocampus. J Neurosci 32:12051-12065. Tissir F, Goffinet AM (2003) Reelin and brain development. Nat Rev Neurosci 4:496-505. Trotter JH, Klein M, Jinwal UK, Abisambra JF, Dickey CA, Tharkur J, Masiulis I, Ding J, Locke KG, Rickman CB, Birch DG, Weeber EJ, Herz J (2011) ApoER2 function in the establishment and maintenance of retinal synaptic connectivity. JNeurosci 31:14413-14423. Weeber EJ, Beffert U, Jones C, Christian JM, Forster E, Sweatt JD, Herz J (2002) Reelin and ApoE receptors cooperate to enhance hippocampal synaptic plasticity and learning. J Biol Chem 277:39944-39952.
Evaluación de la respuesta celular de células madre adultas de origen mesenquimal frente a materiales cerámicos
(Universitat de Barcelona, 2014-06-04) Müller Sánchez, Claudia Alejandra; Reina del Pozo, Manuel; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] Las células madre mesenquimales de tejido adiposo (ADSCs) tienen un gran potencial dentro del campo de la ingeniería de tejidos debido a su fácil obtención, capacidad de diferenciación a múltiples linajes, propiedades inmunomoduladoras y producción de factores proangiogénicos y antiapoptóticos. Asimismo, los materiales cerámicos de fosfato de calcio son ampliamente utilizados como biomateriales en la ingeniería de tejidos del hueso, debido a su similitud con la fase mineral del tejido óseo. Además, su combinación con proteínas de matriz extracelular (ECM), factores osteoinductores y otros tipos celulares, puede incrementar la bioactividad del constructo células-biomaterial. A pesar de ello, pocos trabajos existen en la literatura que evalúen la repuesta de células ADSCs frente a biomateriales cerámicos de fosfatos de calcio, empleando recubrimientos con proteínas de ECM y/o el cocultivo de células ADSCs con células endoteliales, como factores claves para el incremento de la inducción de las células hacia linajes osteogénicos. En este sentido, el objetivo del presente trabajo ha sido Evaluar la biocompatibilidad y diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales adultas derivadas de tejido adiposo (ADSCs) frente a materiales cerámicos de fosfato de calcio con o sin proteínas de matriz extracelular y células endoteliales. Los resultados mostraron que las células mesenquimales obtenidas de tejido adiposo humano (hADSCs), expresan marcadores característicos de células progenitoras (CD29, CD44, CD73, CD90 Y CD105) y se diferenciaron hacia linajes adipogénico, osteogénico, condrogénico y miogénico. Particularmente las señales de diferenciación osteogénicas de las células hADSCs fueron muy potentes y comparables en gran medida con las de otras líneas de osteoblastos ampliamente utilizadas en el campo de la ingeniería de tejidos tales como las MCT3T3 y hFOB 1.19. Por lo tanto son un excelente modelo celular para la evaluación de biomateriales diseñados con la finalidad de favorecer la regeneración ósea. El diseño de una metodología especial para el cultivo celular sobre biomateriales, permitió la cuantificación eficiente y reproducible del porcentaje de células que se adhieren específicamente al material y el seguimiento de su proliferación. Empleando fibroblastos dérmicos humanos (HDF) se demostró que el biomaterial cerámico KeraOs® (KO) es biocompatible según la ISO 10993-5. El estudio de la respuesta de las células hADSCs frente a diversos biomateriales cerámicos, evidenció que las células se adhieren, proliferan y se diferencian hacia un fenotipo osteoblástico sobre los materiales comerciales Bone Ceramic®, Cerasorb® y KeraOs®, aunque no sobre Bio-Oss®. Cada material induce una respuesta osteogénica con un perfil particular en la actividad de la enzima fosfatasa alcalina y la expresión de los genes osteonectina y osteocalcina. Aunque los biomateriales solos desencadenan la diferenciación de las células, la adición de factores inductores en el medio de cultivo potencia la respuesta osteogénica. El recubrimiento del material KeraOs® con fibronectina, colágeno o la combinación FN/COL incrementó significativamente la producción de matriz extracelular, la actividad de la enzima fosfatasa alcalina y la expresión de un mayor número de genes asociados a rutas de diferenciación osteogénicas tales como BMP1, BMP2, Runx2, SMAD1, etc. Sin embargo, respecto a las otras dos proteínas, la fibronectina indujo el mayor aumento en la adhesión celular y la respuesta osteogénica. Por otra parte se observó que el cocultivo de células hADSCs con células endoteliales también incrementó el potencial osteogénico de las células hADSCs. Adicionalmente las células endoteliales formaron estructuras tipo capilar y se incrementó la expresión de marcadores angiogénicos tales como VEGF, VE-cad, α-SMA y Ang-1. Finalmente se evaluó el efecto del biomaterial KeraOs® combinado con fibronectina y células madre autólogas de tejido adiposo sobre la regeneración ósea de perros Beagles. Similar a lo observado con las mesenquimales humanas (hADSCs), las caninas se adhieren, proliferan y se diferencian hacia un fenotipo osteoblástico, evidenciando su utilidad como modelo para el estudio de la regeneración ósea tanto in vitro como in vivo.
Papel de la tirosina quinasa Ack1 en la neuritogénesis y señalización regulada por neurotrofinas y moléculas de guía axonal
(Universitat de Barcelona, 2014-05-30) Masdeu Camara, Maria del Mar; Ureña Bares, Jesús Mariano; Ulloa Darquea, Fausto Alexander; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] Ack1 es una proteína tirosina quinasa citoplasmática que pertenece a la familia de proteínas Ack que está formada por 9 miembros. Ack1 está compuesta por varios dominios de interacción proteína-proteína y un dominio catalítico tirosina quinasa cuya autofosforilación regula parcialmente la función de la proteína (Lougheed et al., 2004). Ack1 se encuentra altamente expresada en cerebro (Urena et al., 2005; La Torre et al., 2006), principalmente en las zonas del hipocampo, corteza cerebral, bulbo olfativo y cerebelo (Urena et al., 2005). Además, se ha demostrado que Ack1 se localiza tanto en dendritas como en regiones presinápticas y su expresión se regula a la alza por un incremento de actividad neuronal (Urena et al., 2005). Las funciones fisiológicas de Ack1 son bastante desconocidas. En conjunto, los datos publicados hasta la actualidad destacan la capacidad de la proteína Ack1 para interaccionar con una gran variedad de proteínas, que indica que Ack1 puede participar en diferentes rutas de transducción de señales, y por tanto, participar en diferentes procesos fisiológicos de las células. Por ejemplo, se ha descrito que puede participar en la regulación del citoesqueleto de actina (Burbelo et al., 1995), en los procesos de endocitosis (Teo et al., 2001), en las cascadas de señalización que resultan de la adhesión celular (Bourdoulous et al., 1998), en la migración celular (Modzelewska et al., 2006), en la proliferación (Nur et al., 2005) y en la supervivencia (Mahajan et al., 2005). La mayoría de funciones de Ack1 conocidas se deducen de las interacciones moleculares de ésta y hasta la actualidad se dispone de muy pocos datos respecto a las competencias biológicas de esta proteína, especialmente a nivel de SNC. Por eso, en esta tesis hemos intentado determinar el papel de la tirosina quinasa Ack1 en las funciones del SNC mediante 5 capítulos de resultados. En el capítulo I explicamos la producción de un anticuerpo monoclonal contra Ack1 que produjimos con el objetivo de poder estudiar la proteína Ack1 a nivel funcional. Este anticuerpo lo produjimos contra la región rica en prolinas de Ack1 con el fin que nos permitiera aumentar la especificidad de nuestros experimentos. En el capítulo II caracterizamos la proteína Ack1 a nivel más funcional. Demostramos que Ack1 es un componente de la vía de señalización de las neurotrofinas, siendo fosforilada en respuesta a neurotrofinas e interaccionando con sus receptores Trk. Además, también describimos que cambios de expresión de Ack1 alteran la neuritogénesis en células PC12 y los patrones de ramificación axonal y dendrítico en neuronas de hipocampo y células granulares de cerebelo. En el capítulo III examinamos la interacción de Ack1 con las proteínas de la densidad postsináptica CaMKII y PSD-95, su fosforilación en respuesta a los estímulos excitadores NMDA y glutamato, y la afectación de los botones axonales de las ramas colaterales de Schaffer por una falta de expresión de Ack1. Los resultados obtenidos en este capítulo apuntan a una posible implicación de Ack1 a nivel de terminales sinápticos. En el capítulo IV nos centramos en estudiar la interacción de Ack1 con la proteína FAK y su participación en procesos de quimioatracción mediados por Netrina-1. Los datos obtenidos sugieren una interacción entre ambas proteínas, que Ack1 se fosforila en respuesta a Netrina-1 y una implicación de la proteína Ack1 en los procesos de quimioatracción mediados por Netrina-1 en células de hipocampo. Finalmente, siendo las proteínas Ack1 y FAK unas proteínas que dependen de su estado de fosforilación para regular su actividad, en el capítulo V de resultados de esta tesis estudiamos las dianas de fosforilación y posibles proteínas de interacción de ambas proteínas, mediante la técnica de espectrometría de masas en muestras de cerebro de ratón en desarrollo, de cerebro de ratón adulto y de cerebro de ratón adulto hiperestimulado. - Bibliografía Bourdoulous S, Orend G, MacKenna DA, Pasqualini R, Ruoslahti E (1998) Fibronectin matrix regulates activation of RHO and CDC42 GTPases and cell cycle progression. The Journal of cell biology 143:267-276. Burbelo PD, Drechsel D, Hall A (1995) A conserved binding motif defines numerous candidate target proteins for both Cdc42 and Rac GTPases. The Journal of biological chemistry 270:29071-29074. La Torre A, del Rio JA, Soriano E, Urena JM (2006) Expression pattern of ACK1 tyrosine kinase during brain development in the mouse. Gene Expr Patterns 6:886-892. Lougheed JC, Chen RH, Mak P, Stout TJ (2004) Crystal structures of the phosphorylated and unphosphorylated kinase domains of the Cdc42-associated tyrosine kinase ACK1. The Journal of biological chemistry 279:44039-44045. Mahajan NP, Whang YE, Mohler JL, Earp HS (2005) Activated tyrosine kinase Ack1 promotes prostate tumorigenesis: role of Ack1 in polyubiquitination of tumor suppressor Wwox. Cancer research 65:10514-10523. Modzelewska K, Newman LP, Desai R, Keely PJ (2006) Ack1 mediates Cdc42-dependent cell migration and signaling to p130Cas. The Journal of biological chemistry 281:37527-37535. Nur EKA, Zhang A, Keenan SM, Wang XI, Seraj J, Satoh T, Meiners S, Welsh WJ (2005) Requirement of activated Cdc42-associated kinase for survival of v-Ras-transformed mammalian cells. Mol Cancer Res 3:297-305. Teo M, Tan L, Lim L, Manser E (2001) The tyrosine kinase ACK1 associates with clathrin-coated vesicles through a binding motif shared by arrestin and other adaptors. The Journal of biological chemistry 276:18392-18398. Urena JM, La Torre A, Martinez A, Lowenstein E, Franco N, Winsky-Sommerer R, Fontana X, Casaroli-Marano R, Ibanez-Sabio MA, Pascual M, Del Rio JA, de Lecea L, Soriano E (2005) Expression, synaptic localization, and developmental regulation of Ack1/Pyk1, a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in the developing and adult brain. The Journal of comparative neurology 490:119-132.
Potential of genetically modified ensheathing cells for regeneration after spinal cord injury = Potencial de la glía envolvente genéticamente modificada para la regeneración después de lesión medular
(Universitat de Barcelona, 2014-03-06) Nocentini, Sara; Río Fernández, José Antonio del; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] La implantación de OECs ha surgido como una terapia prometedora para lesiones medulares, pero sus propiedades regenerativas parecen depender de la presencia de un sustrato permisivo para la migración celular. En esta Tesis Doctoral demostramos que los inhibidores asociados a mielina (IAMs) pueden modular la capacitad migración de las OECs través la interacción y activación del complejo receptor de NgR (el receptor común para los IAMs). Con el uso de la microscopia de tracción, demostramos cuantitativamente que las OECs disminuyen en gran medida su fuerza de tracción sobre la mielina. Además, esta disminución se pudo correlacionar con una disminución de las adhesiones focales y la redistribución del citoesqueleto de F-actina. La incubación con el péptido NEP1-40, que bloquea NgR1, restableció in gran parte la capacitad migratoria, las fuerzas de tracción de estas células y su organización citoesqueletal. En base a los resultados obtenidos exploramos la viabilidad de dos estrategias diferentes para mejorar las propiedades migratorias de la OECs. Una de ellas trataba del posible uso de nanoparticulas magnéticas para guiar a las células. Aunque esta técnica no aumenta la velocidad intrínseca de migración de las células, permite la concentración y la guía de las mismas hace a un área específica después de la implantación in vivo. Pudimos comprobar que las OECs marcada con NPM no exhiben respuestas celulares asociadas al estrés, y pueden ser guiadas por un campo magnético in vitro. Además comprobamos que las células se integraban bien después de su trasplante de en un modelo organotípico de regeneración de médula espinal/nervio ciático. La segunda estrategia consistió en modificar genéticamente las OECs para que expresaran un ectodomínio por el NgR1 para bloquear los efectos negativos de los IAMs sobre su migración. Pudimos observar que las células modificadas migran más in vitro sobre un sustrato de mielinas comparadas con OECs normales. Además, una vez implantadas en una médula no lesionada, las células modificadas se integran bien en el modelo y migran más que células normal. Los resultados obtenidos indican un potencial terapéutico de ambas estrategias.
Analysis of Reelin function in the molecular mechanisms underlying Alzheimer’s disease
(Universitat de Barcelona, 2013-10-16) Rossi, Daniela; Soriano García, Eduardo; Pujadas Puigdomènech, Lluís; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] La Reelina es una proteína de la matriz extracelular crucial para el desarrollo neural. Además, estudios recientes han demostrado que en el cerebro adulto Reelina controla eventos de plasticidad sináptica y neurogénesis. La cascada de señalización de Reelina ha sido previamente relacionada con la enfermedad de Alzheimer (EA). Sin embargo, aún no se conoce exactamente el papel que Reelina juega en la enfermedad. La EA es la forma más común de demencia en personas mayores y se caracteriza por una dramática pérdida progresiva de sinapsis y poblaciones neuronales. A nivel histopatológico se han descrito dos características principales: los ovillos neurofibrilares (paquetes intracelulares de la proteína Tau hiperfosforilada ) y las placas amiloides (depósitos extracelulares de péptido Aβ). El péptido Aβ se genera por el corte proteolítico de la proteína transmembrana APP (Amyloid precursor protein) por la acción secuencial de las proteasas de membrana β- y γ-secretasa. El Aβ monomérico comienza a agregarse en especies oligoméricas solubles, capaces de provocar disfunción sináptica en la EA. El proceso de agregación termina con la formación de fibrillas amiloides, los constituyentes principales de las placas. En esta tesis se demuestra que Reelina retrasa in vitro la formación de fibrillas amiloides, hasta que queda secuestrada en las mismas, perdiendo su actividad biológica. Además, Reelina protege contra la muerte neuronal y el daño sináptico inducidos por oligómeros de Aβ. También se generan modelos murinos de EA sobreexpresantes de Reelina. En uno de estos modelos (TgRln/J20) se demuestra que la expresión transgénica de Reelina disminuye in vivo la deposición de placas amiloides, previene la pérdida de espinas dendríticas y rescata el deterioro cognitivo asociado a este modelo de EA. En otro modelo (TgRln/GSK-3β) la sobreexpresión de Reelina reduce la fosforilación de Tau. El conjuntos de datos presentados en esta tesis indica que, al disminuir la formación de placas amiloides, al proteger contra la muerte neuronal y la pérdida sináptica, al reducir la fosforilación de Tau y al prevenir el deterioro cognitivo de la EA, la vía de Reelina debe ser considerada una estrategia terapéutica para el tratamiento y la mejora de la patogénesis de la EA.
La proteína priónica celular: Análisis de su función neuroprotectora y reguladora del ciclo Celular
(Universitat de Barcelona, 2013-11-29) Carulla Martí, Patricia; Río Fernández, José Antonio del; Llorens Torres, Franc; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son un conjunto de enfermedades neurodegenerativas letales que afectan tanto animales como humanos. Están causadas por unas partículas proteicas denominadas “priones”, resultantes de la transformación de la proteína priónica celular (PrP(C)) a una forma patogénica denominada PrP(SC), que se acumula en el cerebro en forma de agregados e induce la transformación de más moléculas a expensas de la reducción de los niveles de PrP(C). Hasta el día de hoy, el estudio de las prionopatías se ha centrado en la bioquímica, toxicidad y transmisibilidad de PrP(SC). Sin embargo, la pérdida de la proteína endógena puede también contribuir al desarrollo de la enfermedad. A día de hoy, la función fisiológica de PrP(C) está aún por esclarecer, aunque los análisis realizados la involucran en procesos de: i) ciclo celular y proliferación, ii) homeostasis del cobre, iii) neuroprotección, iv) transmisión sináptica y v) señalización intracelular, entre otros. Esta Tesis Doctoral aborda la función de PrP(C) en la regulación del ciclo celular y la neuroprotección, ampliando los conocimientos existentes mediante la descripción de las vías moleculares implicadas en ambos procesos. Nuestros datos describen a PrP(C) como una proteína capaz de integrar gran variedad de señales extracelulares y generar respuestas a través de la modulación de diferentes vías de señalización asociadas. Hemos observado como la modulación transitoria de los niveles de PrP(C) en una línea celular de neuroblastoma produce cambios dosis-dependientes sobre los mecanismos de proliferación celular. Estas alteraciones son debidas a la interacción de la proteína con EGFR y la consiguiente activación de las vías ERK1/2 y AKT, que incluyen entre sus dianas a elementos reguladores del ciclo celular. PrP(C) también parece ejercer cierta influencia sobre la formación de filopodios en este tipo celular, regulando la dinámica del citoesqueleto de actina por su acción sobre las Rho GTPasas, concretamente, vía Cdc42-N-WASP. Por otro lado, el uso de un modelo in vivo de excitotoxicidad por KA nos ha permitido entrar en detalle en la función neuroprotectora de PrP(C). Se conoce que tanto la susceptibilidad incrementada de los ratones Prnp-knockout a agentes convulsionantes como el daño neurotóxico derivado a nivel del hipocampo, son debidos a la activación de la vía JNK3 de muerte celular. Sin embargo, nuestros resultados obtenidos in vivo de ratones Prnp0/0 Jnk3+/+ y Prnp0/0 Jnk30/0 describen por primera vez la participación de PrP(C) en la modulación de esta vía de señalización. Hemos descrito como la proteína priónica interactúa a nivel postsináptico con la subunidad GluR6/7 de los receptores de glutamato, bloqueando por un lado la formación del complejo trimérico GluR6/7-PSD-95-MLK3 que lleva a la activación de la vía JNK3 y, por otro, modulando la actividad del receptor, que es un factor determinante de la excitabilidad neuronal incrementada propia de un episodio epiléptico. Esta Tesis Doctoral supone, por lo tanto, un avance en el conocimiento de la función fisiológica de PrP(C) y, consecuentemente, en el estudio de la fisiopatología de la enfermedad priónica. La implicación de esta proteína en procesos proliferativos esenciales durante la neurogénesis así como en la regulación de la transmisión sináptica, deja entrever que PrP(C) es esencial para el desarrollo y mantenimiento de los circuitos neuronales. Probablemente, las alteraciones derivadas de la reducción de los niveles de PrP(C) se suman a los efectos neurotóxicos de la agregación de PrP(SC), dando lugar al desarrollo de la enfermedad. Asimismo, la descripción de los mecanismos moleculares y vías de señalización reguladas por PrP(C) también abre las puertas a la identificación de nuevas dianas terapéuticas para la prevención o tratamiento de las EETs.
Characterization of the Armcx/Almc10 gene family function in mitochondrial dynamics and neural development
(Universitat de Barcelona, 2013-07-26) Mirra, Serena; Soriano García, Eduardo; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa]Los genes Armcx pertenecen a una misma familia localizada en el cromosoma X y caracterizada por la posesión de dominios armadillo en su secuencia proteica. En este trabajo se ha analizado la expresión de los genes Armcx/Armc10 durante el desarrollo embrionario, en los tejidos neurales en desarrollo y en el cerebro adulto. A continuación se ha analizado localización subcellular de las proteínas Armc10 y Alex3 (codificada por el gen Armcx3), que se encontraron mayoritariamente localizadas a núcleo y mitocondria. La sobreexpresión de Armc10 y Alex3 provoca la agregación y/o “tethering” mitocondrial en las neuronas, donde estos procesos sirven para anclar estas organelas en localizaciones específicas que requieren una alta demanda de energía y unos requerimientos de taponamiento de Ca2+. En la base de nuestros datos bioquímicos y de los estudios funcionales proponemos un modelo en el que las proteínas Alex3 y Armc10 son reguladores positivos del tráfico mitocondrial, interaccionando directamente con los complejos Miro/Trak2. Además, como se muestra para el complejo KIF5/Miro/Trak2, el incremento de la actividad neuronal que conlleva a incrementos en Ca2+ es probablemente la causa del desensamblaje del complejo y de la parada mitocondrial en los lugares de neurotransmisión activa, completando por lo tanto los requerimientos bioenergéticos de la transmisión neuronal. A continuaciòn utilizamos la médula espinal de pollo como modelo fisiológico in vivo para explorar la función de Alex3 y Armc10 en el desarrollo neural. Se encontró que Alex3 cumple un papel regulador por inhibición de la vía de Wnt/β-catenina. También demostramos que Alex3 está involucrado tanto en la regulación negativa del ciclo celular como en la inducción de la diferenciación de precursores neuronales. Por otro lado, Armc10 sólo se encontrò implicado en la regulación negativa del ciclo celular. Estas diferencias entre los efectos de la sobreexpresión de Alex3 y Armc10 en procesos llave del desarrollo de la médula espinal, evidencian las divergencias funcionales entre las dos proteínas, sugiriendo que Alex3 puede haber adquirido funciones adicionales respecto a Armc10, ancestro filogenético del cluster Armcx. Globalmente nuestros datos sugieren que la vía de señalización de Wnt puede estar regulando procesos llave del desarrollo a través de las proteínas mitocondriales Alex3 y Armc10.
Paper de les Proteïnes Sinàptiques i l'Exocitosi en els processos de Guia Axonal i Migració
(Universitat de Barcelona, 2013-06-27) Ros i Torres, Oriol; Soriano García, Eduardo; Cotrufo, Tiziana; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[cat] La guia axonal i la migració són dos processos similars i crucials per al desenvolupament. Aquests dos elements permeten el correcte posicionament cel•lular i la selecció de dianes essencial per a la funcionalitat posterior del sistema nerviós central, i es fonamenten en la regulació de l’avanç del con de creixement o la cèl•lula, respectivament, en resposta a estímuls externs, quimioatraients i quimiorepulsius, proporcionats per molècules de guia. Un altre component clau del funcionament neuronal és l’exocitosi, que permet la propagació dels estímuls nerviosos entre cèl•lules a través de la fusió de vesícules amb la membrana plasmàtica i l’alliberament de neurotransmissors. L’exocitosi està vehiculada per les proteïnes SNARE, que es troben a la membrana cel•lular i de la vesícula i que, a través de la unió paral•lela dels dominis catalítics, aproximen les membranes plasmàtica i vesicular possibilitant-ne la fusió Malgrat posseir la maquinària necessària per a l’exocitosi, les neurones en desenvolupament no presenten estructures especialitzades per a la transmissió del senyal com són les sinapsis, i es creu que el paper de les proteïnes del complex SNARE rau en el manteniment de la homeòstasi de membrana. Conceptualment, és fàcil pensar que la guia axonal i la migració actuïn a través del control precís de la dinàmica de la membrana, augmentant localment la superfície de la neurona i expandint-la en la direcció del creixement. En aquesta tesi hem investigat el paper de la dinàmica de membrana en la guia axonal i la migració. Concretament, ens hem centrat en l’estudi de la interacció del receptor de la Netrina-1 amb les proteïnes del complex SNARE en dos sistemes bàsics per a l’establiment de connexions del cervell: la guia dels axons de neurones de l’hipocamp i la migració de les neurones del llavi ròmbic atrets cap a una font de Netrina-1. També hem estudiat l’efecte del silenciament de les proteïnes del complex SNARE en dos paradigmes de guia axonal in vivo: la navegació dels axons de les cèl•lules comissurals de la medul•la espinal cap a, a través i més enllà de la línia mitja, i la innervació de l’extremitat inferior per part de les motoneurones d’embrions de pollastre. El tercer focus d’atenció ha estat l’estudi de la dinàmica de membrana i l’exocitosi al con de creixement de neurones d’hipocamp murí en resposta a estímuls quimioatraients de Netrina-1. Els resultats obtinguts durant aquesta tesi han demostrat que el receptor de la atractiu de la Netrina-1 DCC interacciona in vivo amb les proteïnes del complex SNARE Sintaxina1 i TI-VAMP, però no amb SNAP25 o VAMP2 en cèl•lules d’hipocamp i neurones migrants del llavi ròmbic inferior. A més, la interacció de DCC amb Sintaxina1 està regulada pel lligand, però l’exocitosi del receptor de Netrina-1 no es veu afectada per tractaments amb toxines que proteolitzen Sintaxina1. Hem descrit que les proteïnes del complex SNARE són imprescindibles per a la guia dels axons de neurones comissurals i motoneurones , perquè el silenciament de Sintaxina1, SNAP25, VAMP2 o TI-VAMP causa defectes en la navegació dels seus axons compatibles amb alteracions de diversos sistemes (molècula guia-receptor) de guia axonal. Per últim, hem descrit la dinàmica de membrana i l’exocitosi a nivell del con de creixement amb una tècnica innovadora, que permet la monitorització de l’exocitosi en temps real, i, i hem descrit com la Netrina-1 incrementa l’exocitosi dependent de proteïnes SNARE a nivell del con de creixement i les vies de senyalització que hi estan implicades.
Estudio de procesos de Migración y Plasticidad en el Sistema Nervioso Central: Papel de Semaforina 4F y kinasa de adhesión focal (FAK)
(Universitat de Barcelona, 2013-02-15) García García, Beatriz; Soriano García, Eduardo; Burgaya i Márquez, Ferran; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] La presente tesis doctoral presenta varios resultados fundamentales para la ampliación del conocimiento actual de procesos importantes en la generación de los circuitos neuronales, como son la migración y la ramificación de células neurales. En primer lugar, se ha determinado la expresión de la semaforina transmembranal 4F en cerebro de ratón en desarrollo y adulto. Así, se ha visto que se expresa en diversas áreas del cerebro, y se ha encontrado expresión de esta proteína en precursores neuronales y en neuronas maduras, principalmente en dendritas, y en células del linaje oligodendroglial.
Estudio de las vías de señalización intracelular asociadas a las proteínas inhibitorias de la mielina
(Universitat de Barcelona, 2012-07-10) Seira Oriach, Oscar; Río Fernández, José Antonio del; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[eng] Lesioned axons do not regenerate in the adult mammalian central nervous system, owing to the overexpression of inhibitory molecules such as myelin-derived proteins or chondroitin sulphate proteoglycans. In order to overcome axon inhibition, strategies based on extrinsic and intrinsic treatments have been developed. For myelin-associated inhibition, blockage with NEP1-40, receptor bodies or IN-1 antibodies has been used. In addition, endogenous blockage of cell signalling mechanisms induced by myelin-associated proteins is a potential tool for overcoming axon inhibitory signals. We examined the participation of glycogen synthase kinase 3 (GSK3beta) and ERK1/2 in axon regeneration failure in lesioned cortical neurons. We also investigated whether pharmacological blockage of GSK3beta and ERK1/2 activities facilitates regeneration after myelin-directed inhibition in two models: i) cerebellar granule cells and ii) lesioned entorhino-hippocampal pathway in slice cultures, and whether the regenerative effects are mediated by Nogo Receptor 1 (NgR1). We demonstrate that, in contrast to ERK1/2 inhibition, the pharmacological treatment of GSK3beta inhibition strongly facilitated regrowth of cerebellar granule neurons over myelin independently of NgR1. Lastly these regenerative effects were corroborated in the lesioned EHP in NgR1 -/- mutant mice. These results provide new findings for the development of new assays and strategies to enhance axon regeneration in injured cortical connections. On the other hand, and focused in the OMgp, by using recording electrophysiological nano-devices we found that, OMgp has a role in synaptic transmission, since it can induce excitatory postsynaptic potentials (EPSPs) in cultured hippocampal neurons.
Papel de Alex3 en la vía de señalización de Wnt y en la dinámica mitocondrial
(Universitat de Barcelona, 2012-06-21) Serrat Reñé, Román; Soriano García, Eduardo; Burgaya i Márquez, Ferran; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] La proteína Alex3 forma parte de la familia de genes exclusiva de los mamíferos euterios Armcx, caracterizada por presentar una alta expresión en el SNC, por encontrarse localizada en clúster en el cromosoma X y porque se originaron a partir de la retrotransposición del gen Armc10 y una rápida duplicación en tándem en una evolución temprana de los mamíferos euterios. Las proteínas Armcx/Armc10 poseen primariamente una localización subcelular bimodal, encontrándose asociadas a la membrana externa mitocondrial y en el núcleo celular, localización que concuerda con sus secuencias proteicas que poseen putativos dominios de localización en estos compartimentos. La sobreexpresión de las proteínas Armcx/Armc10 produce una profunda alteración de la red mitocondrial, demostrando que esta familia de proteínas juega un papel importante en la regulación de la dinámica y agregación mitocondrial y al menos, la sobreexpresión de la proteína Alex3, no induce cambios en los parámetros bio-energéticos mitocondriales, tales como el consumo de oxígeno, el potencial de membrana, el contenido de DNA mitocondrial, la actividad de la citocromo c oxidasa o la recaptación de Ca2+, ni alteran el balance de fisión/fusión mitocondrial. Tanto la sobreexpresión como el silenciamiento de las proteínas Alex3 y Armc10 en neuronas hipocampales se ha visto alteran la distribución y transporte mitocondrial. Las proteínas Alex3 y Armc10 interaccionan con el complejo Kinesina/Miro/Trak2, regulador del transporte mitocondrial, lo cual sugiere que esta familia de proteínas regularían el transporte y dinámica mitocondrial a través de este complejo de proteínas. La interacción de Alex3 con este complejo también se ha visto es dependiente de los niveles de Ca2+, reduciéndose la interacción de estas proteínas cuando los niveles de Ca2+ son elevados. Por otra parte, la vía de señalización asociada a proteínas Wnt se ha visto induce la degradación de la proteína Alex3 por un proceso independiente del proteosoma. Esta degradación no depende de los componentes de la vía canónica Dishevelled, GSK3-β y β-catenina ni de los componentes no canónicos JNK, CAMKII y calcineurina, habiéndose demostrado que la PKC y la CK2 juegan un papel principal en el control y degradación de los niveles de la proteína Alex3 de forma dependiente e independiente de las vías de señalización de Wnt. De manera similar, la depleción de los niveles intracelulares de Ca2+ también reproduce la degradación de Alex3. Además, la degradación de Alex3 a través de las vías de señalización asociadas a las proteínas Wnt revierte los fenotipos de agregación mitocondrial inducidos por la sobreexpresión de Alex3 y es evitado por la activación de la PKC, lo que sugiere que las proteínas Wnt podrían jugar un papel en el control de la dinámica mitocondrial mediante la regulación de las proteínas Armcx.
Optimización de ensayos celulares para la detección de toxinas marinas responsables de intoxicaciones alimentarias. Aplicación en extractos lipofílicos de muestras naturales de "Mytilus galloprovincialis"
(Universitat de Barcelona, 2012-06-15) Cañete Ortiz, Elisabet; Diogène Fadini, Jorge; Durfort i Coll, Mercè; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] Esta tesis doctoral tiene por objeto el estudio de la aplicabilidad de los cultivos celulares de mamífero como uso de métodos toxicológicos alternativo al uso de métodos establecidos con animales de experimentación en la detección y cuantificación de toxinas marinas responsables de intoxicaciones alimentarias. Incluye cuatro artículos ya publicados y un manuscrito sometido a publicación en revista indexada. Hasta el momento, el uso de los ensayos celulares (Cell Based Assays, CBAs) como métodos toxicológicos de detección y cuantificación de toxinas marinas en alimentos de origen alimentario se había enfocado por grupos de toxinas con mecanismo de acción similar. En esta tesis, lo que se ha propuesto es simplificar la estrategia de uso de los CBAs mediante un único modelo celular capaz de detectar y cuantificar el efecto tóxico del mayor número de grupos de toxinas partiendo de las siguientes prioridades:  Sensibilidad y repetitividad de respuesta del/os ensayo/s a la detección de la toxicidad teniendo en cuenta los mecanismos de toxicidad implicados.  Reducción del tiempo, complejidad y costes del método.  Interpretación de los resultados.  Priorización de la puesta a punto del método para aquellas toxinas que tienen un mayor impacto en las zonas de muestreo de este estudio. Los pasos seguidos en la optimización se han dividido en dos grandes bloques: Un primer bloque en el que se trabajó con toxinas purificadas estándar a fin de establecer las condiciones de los ensayos para la detección y cuantificación de las toxinas, así como contribuir a la caracterización toxicológica de las diferentes toxinas. Un segundo bloque, en el que se trabajó con muestras naturales con toxinas a fin de establecer las condiciones en situaciones reales. Para evaluar la respuesta del CBA frente a toxinas purificadas se escogieron toxinas representativas de los grupos más comunes. Para el primer grupo de ensayos (Cañete and Diogène, 2008) se utilizó: STX, PbTx-3, PlTX, PTX-2, OA, DTX-1, DA. Para el segundo grupo de ensayos (Cañete and Diogène, 2010) se amplíaron los estudios a toxinas actuando sobre canales de sodio dependientes de voltaje (STX, PbTx-3 y P-CTX) y a toxinas lipofílicas (OA, DTX-1, PTX-2, YTX y AZA-1). Para evaluar la respuesta del CBA frente a muestras naturales con toxinas (Caillaud et al., 2009; Cañete et al., 2010; Cañete et al.) se utilizaron muestras de bivalvos procedentes del Delta del Ebro. Por su elevada importancia en el área geográfica en la que nos encontramos, este trabajo se centró en la optimización del CBA para toxinas del tipo lipofílico. En este trabajo se proponen como conclusiones unas directrices a seguir para el uso de CBAs en este contexto. PUBLICACIONES Caillaud, A., Cañete, E., De la Iglesia, P., Giménez, G., Diogène, J., 2009. Cell-based assay coupled with chromatographic fractioning: A strategy for marine toxins detection in natural samples. Toxicology in Vitro 23 (8), 1591-1596. Cañete, E., Campàs, M., De la Iglesia, P., Diogène, J., 2010. NG108-15 cell-based and protein phosphatase inhibition assays as alternative semiquantitative tools for the screening of lipophilic toxins in mussels. Okadaic acid detection. Toxicology in Vitro 24 (2), 611-619. Cañete, E., De la Iglesia, P., Diogène, J., Evaluation of a toxicological alternative tool for lipophilic toxicity screening in mussels. NG108-15 cell-based assay coupled to chromatographic fractioning; a case study for YTX contamination. Toxicology in Vitro. Submitted. Cañete, E., Diogène, J., 2008. Comparative study of the use of neuroblastoma cells (Neuro-2a) and neuroblastoma x glioma hybrid cells (NG108-15) for the toxic effect quantification of marine toxins. Toxicon 52 (4), 541-550. Cañete, E., Diogène, J., 2010. Improvements in the use of neuroblastoma x glioma hybrid cells (NG108-15) for the toxic effect quantification of marine toxins. Toxicon 55 (2-3), 381-389.
Sexual Reproduction in Demosponges: Ecological and Evolutive Implications / Reproducción sexual en demosponjas: implicaciones ecológicas y evolutivas.
(Universitat de Barcelona, 2007-11-16) Riesgo Gil, Ana; Maldonado Barahona, Manuel; Durfort i Coll, Mercè; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[eng] The reproductive biology of poriferans is still poorly understood. We have investigated the sexual reproductive biology of seven demosponge species, six of them from the Mediterranean ( Corticium candelabrum, Crambe crambe, Raspaciona aculeata, Axinella damicornis, Chondrosia reniformis, and Petrosia ficiformis), and one from the Pacific coast of Canada ( Asbestopluma occidentalis). The thesis consists of a general introduction, 7 different chapters and a general discussion. Chapter 1. It is well established that in temperate regions invertebrates restrict their reproductive cycles to the warm periods. The sexual cycle of A. damicornis, C. candelabrum, C. reniformis, and R. aculeata is very different in timing and duration, despite all of them shared habitat and thermal regime. While the gametogenesis of R. aculeata and C. reniformis underwent during summer and autumn (warm periods in the Mediterranean), the gametogenesis of C. candelabrum and A. damicornis occurred during winter. Therefore, the relationship between gametogenesis and temperature in temperate waters was not straightforward, and many different relationships appeared. Chapter 2. The oogenesis of C. candelabrum resulted in a surprising long process, with continuous production of oocytes. However, the oocyte maturation extended for 7/8 months during autumn and winter. Spermatogenesis occurred during 4 or 5 at the end of the oocyte maturation (spring and summer). Spermatozoans were primitive but possessed a true C-shaped acrosome. Chapter 3. The gametogenesis of the oviparous demosponge P. ficiformis occurred during autumn and early winter. Large oocytes and round primitive spermatozoans with proacrosomal vesicles were released to the water on December. Recently fertilised eggs were placed in Petri dishes. Since no free-swimming larva was observed, the development in this demosponge was suggested to be direct. Chapter 4. The reproduction of the carnivorous sponge A. occidentalis was studied under light and electron microscopy. It was a contemporaneous hermaphroditic sponge with clusters of oocytes and very complex spermatic cysts. The fertilisation mechanism was unusual for the phylum Porifera, and shared many similarities with the feeding mechanism of this carnivorous sponge. Chapter 5. The spermatogenesis of the common Mediterranean demosponge C. crambe was investigated by light and electron microscopy. The mature spermatozoan was a extremely modified cell, with the body bent at the level of the flagellum insertion, a true acrosome, and a striated rootlet that connected the basal body to the mitochondrion. In addition, such modifications resembled to the sperm morphology of a phoronid, in a well example of adaptive convergence. Chapter 6. The oogenesis in A. damicornis and R. aculeata was very similar, except for the duration. While it extended for 5 months in R. aculeata, A. damicornis required 7 months to complete it. The differences resided in the vitellogenesis. Yolk was almost exclusively auto-synthesized in A. damicornis from digestion of bacteria. However, in R. aculeata the process shortened because of the help of nurse cells in creation of yolk. Chapter 7. Unspawned sperm and precursors of sperm cells were phagocytosed by motile phagocytic cells in the spermatic cysts of P. ficiformis and R. aculeata. All these features observed for the first time in demosponges revealed that sponges contain many complex features and are capable of complex processes that are usually regarded to higher invertebrates and vertebrates.
Análisis de los mecanismos y factores implicados en el desarrollo, especificidad y maduración de la conexión septohipocámpica. Implicaciones en la enfermedad de Alzheimer
(Universitat de Barcelona, 2012-11-27) Rubio Abejón, Sara Esmeralda; Pascual Sánchez, Marta; Soriano García, Eduardo; Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular
[spa] La conexión GABAérgica septohipocámpica es un elemento crucial para el correcto funcionamiento del hipocampo y, en concreto, para determinados procesos de aprendizaje y memoria. La exquisita especificidad de contacto de este componente es la piedra angular que determina su función, pero los datos existentes sobre los mecanismos que rigen la selección de diana y sinaptogénesis de estos axones son escasos. Aunque esta conexión desempeña un papel elemental en procesos cognitivos que están afectados durante el envejecimiento y en la enfermedad de Alzheimer, en el momento en que iniciamos este proyecto había un sorprendente vacío en la literatura sobre el estado de la vía GABAérgica septohipocámpica en estas situaciones. Hemos establecido el modelo in vitro del desarrollo de la conexión septohipocámpica, mediante cultivos organotípicos que constan de septum, hipocampo y corteza entorrinal obtenidos de animales neonatales. La conexión septohipocámpica se forma en nuestro modelo in vitro manteniendo la exquisita especificidad de contacto de su componente GABAérgico. Hemos comprobado, mediante el uso de tejido proveniente de ratones knock-out para Semaforina 3C y mediante la aplicación de ectodominios bloqueantes de los receptores de Semaforina 3C, que esta molécula es prescindible para el proceso de sinaptogénesis específica de los axones GABAérgicos septohipocámpicos in vitro. Utilizando el cultivo puesto a punto también hemos demostrado que las aferencias de corteza entorrinal a hipocampo no son necesarias para que la conexión se forme de manera específica. Se ha llevado a cabo un análisis exhaustivo de la inervación y complejidad de las sinapsis de la conexión GABAérgica septohipocámpica sobre diferentes tipos de interneuronas del hipocampo de ratones wild-type a diferentes edades (2, 8 y 18 meses), así como de ratones de la cepa transgénica J20 (modelo murino de enfermedad de Alzheimer) a 2 y 8 meses de edad. Los resultados de estos experimentos muestran que durante el envejecimiento normal, en ratones wild-type de 18 meses, se produce una disminución tanto en el número de fibras GABAérgicas septohipocámpicas como en la complejidad de sus contactos sinápticos. Estos déficits de la conexión GABAérgica septohipocámpica se producen de manera acelerada en ratones J20, modelo de enfermedad de Alzheimer. En esta cepa transgénica, los déficits histológicos observados van acompañados de alteraciones funcionales: disminución en la potencia de los ritmos theta y gamma hipocámpicos. El análisis del estado funcional del hipocampo de ratones J20 demuestra que la sinapsis CA3-CA1 funciona normalmente en los animales transgénicos J20, aunque con alteraciones sutiles en la facilitación sináptica a corto plazo. Los procesos de potenciación a largo plazo (LTP) de esta sinapsis están aumentados en el modelo de EA. En un paradigma de condicionamiento operante de autoestimulación, en que los animales pueden autoadministrarse estímulos eléctricos reforzantes en el septum medial, los animales J20 presentan peor aprendizaje y ejecución de la tarea. Hemos demostrado que, en animales WT, este refuerzo operante se correlaciona con una disminución de la respuesta obtenida en la sinapsis CA3-CA1. Los transgénicos J20 no presentan tal disminución, especialmente durante los primeros días del test, y por tanto muestran peor aprendizaje y ejecución del paradigma de refuerzo operante, como se observa en nuestros resultados. En estos mismos animales, además, la inducción de LTP afecta negativamente la ejecución de la tarea reforzante ya adquirida, seguramente porque la excesiva respuesta de la sinapsis una vez potenciada cancela esa disminución de la respuesta en CA3-CA1 que es necesaria para que tenga lugar el refuerzo operante.

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