Tesis Doctorals - Departament - Ciències Fisiològiques I

URI permanent per a aquesta col·leccióhttps://hdl.handle.net/2445/36584

Estadístiques

Examinar

Mostrant 1 - 20 de 44

Optimización y estandarización de un protocolo para el estudio de perfiles peptídicos séricos mediante la tecnología Maldi-Tof MS. Aplicación en la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico precoz
(Universitat de Barcelona, 2015-11-27) Rico Santana, Naira; Ferrer Navarro, Mario; Jiménez Povedano, Wladimiro; Universitat de Barcelona. Departament d'Àlgebra i Geometria
[spa] El estudio de perfiles peptídicos mediante la tecnología de espectrometría de masas MALDI-TOF es una metodología útil y prometedora para la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico. Sin embargo, existen muchos factores que pueden influir en la variabilidad de los resultados obtenidos. Un análisis previo de dichos factores, así como el diseño de un protocolo estandarizado que sea óptimo para la búsqueda de los biomarcadores que se buscan, es fundamental si no se quiere fracasar en el estudio de investigación. En el presente trabajo se ha diseñado un protocolo estandarizado y optimizado para el estudio de perfiles peptídicos séricos que incluye las fases preanalítica, analítica y postanalítica, con el objetivo de poder ser aplicado a diferentes patologías en la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico precoz. La fase preanalítica se automatizó mediante el uso de un robot, siguiendo el protocolo previamente optimizado de forma manual. Tras la automatización, se evaluó su efecto en la reproducibilidad de los resultados a partir del cálculo del CV interdía del área media de cada uno de los picos presentes en el espectro. El CV interdía pasó de ser un 62%, cuando el proceso se realizaba de forma manual, a un 11.6% cuando se automatizó el proceso. En el presente trabajo también se ha analizado la influencia del género y la edad sobre los perfiles peptídicos séricos llegando a la conclusión de que el efecto de estas dos variables es mínimo y se puede considerar despreciable. Para el análisis estadístico de los resultados, se diseñó un modelo estadístico capaz de buscar la combinación que, con menor número de péptidos, consiguiera discriminar entre los grupos de estudio con una mayor sensibilidad y especificidad diagnóstica. El protocolo estandarizado y optimizado se aplicó a la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico precoz de cáncer de páncreas. Tras el estudio se obtuvo un panel de biomarcadores que mejoraba la capacidad diagnóstica del marcador clásico CA 19.9 añadiendo los péptidos seleccionados en el estudio (1006,52 Da y 1929,65 Da). Con este panel, se mejora notablemente la sensibilidad diagnóstica de un 75,5% (CA 19.9) a un 89,8% (panel) y la especificidad diagnóstica de un 87,3% (CA 19.9) a un 92,7% (panel). Dichos resultados quedan pendientes de validación e identificación de los péptidos seleccionados. En el estudio de cáncer de páncreas también se concluye que el péptido 4155 Da es característico de enfermedad pancreática. Dicho péptido queda pendiente de validación e identificación. El protocolo estandarizado y optimizado también se aplicó en un estudio de búsqueda de biomarcadores de diagnóstico precoz de ictus isquémico. En este estudio se concluye que el péptido 2155 Da es un buen biomarcador de diagnóstico precoz con un sensibilidad diagnóstica del 88,6% y una especificidad diagnóstica del 96,9% para discriminar entre ictus isquémico y controles sanos. Además, el péptido 2155 Da puede discriminar entre ictus isquémico y enfermedad neurológica aguda al presentar diferente patrón de expresión a lo largo del tiempo en ambas patologías. Queda pendiente la validación de este resultado así como la identificación del péptido. Tras los resultados obtenidos, se puede concluir que el protocolo optimizado y estandarizado propuesto en el presente trabajo de tesis, es útil y se puede aplicar a distintos tipos de patología con el objetivo de encontrar biomarcadores séricos de diagnóstico precoz.
Nuevos tratamientos contra la hipertensión portal en la cirrosis hepática experimental: 1. Nanopartículas de óxido de cerio y 2. Agonismo parcial del receptor V1a de la vasopresina
(Universitat de Barcelona, 2016-10-21) Oró Bozzini, Denise; Jiménez Povedano, Wladimiro; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[spa] La cirrosis afecta a un gran número de pacientes en el mundo, de hecho constituye una de las enfermedades más prevalente en los países occidentales. Puede ser definida como el estadio final de la fibrosis hepática, que consiste en la formación de nódulos y en la alteración de la función hepática. La fibrosis hepática se produce como consecuencia de una cicatrización continua en respuesta a un daño crónico en el hígado. En los últimos 20 años ha habido un gran progreso en el conocimiento de los mecanismos moleculares que se dan en la fibrosis hepática y, en particular, en las vías moleculares que conectan la inflamación crónica del hígado con la fibrosis hepática progresiva. Las investigaciones que están en marcha tienen como diana estos mecanismos moleculares, en un esfuerzo para atenuar la respuesta fibrogénica. Sin embargo, actualmente la mejor terapia para las enfermedades crónicas del hígado continúa siendo la eliminación de la causa primaria de la enfermedad. A pesar de ello existen casos donde no es posible o no es suficiente con eliminar el agente etiológico. Es por tanto fundamental identificar nuevas estrategias terapéuticas que permitan detener o revertir la progresión de la enfermedad hepática. Una de las terapias más prometedoras y que ya ha sido evaluada en pacientes con enfermedad hepática crónica, son los compuestos antioxidantes. El estrés oxidativo se produce por medio de un aumento de las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno (ROS, RNS) y/o una disminución de los antioxidantes presentes en el hígado. Las ROS y RNS tienen un rol crucial en la inducción y progresión de la enfermedad hepática, independientemente de su etiología. Las nanopartículas de CeO2 debido a su tamaño, estructura y composición química presentan una gran afinidad por el hígado, y a diferencia de otros compuestos antioxidantes, son auto-regenerativas, de manera que permiten evitar una administración continuada. En este sentido, el primer objetivo de la presente tesis doctoral fue investigar el efecto antioxidante de las nanopartículas de CeO2 en ratas con fibrosis hepática, así como el papel que ejerce esta propiedad terapéutica en la inflamación y en la consecuente hipertensión portal. Por otra parte, las nuevas estrategias no sólo se deben dirigir a prevenir y/o revertir la fibrosis hepática, sino que también es importante atenuar los principales trastornos que aparecen en los pacientes con cirrosis hepática avanzada. Dentro de estos trastornos, la hipertensión portal es un síndrome clínico frecuente en los pacientes con cirrosis y se caracteriza por un incremento en la presión venosa portal. En estos pacientes la hipertensión portal es la principal causa de muerte y de trasplante de hígado. Es por ello que se reducción representa una de las principales dianas terapéuticas para mejorar la prognosis en los pacientes con cirrosis avanzada. Estudios han demostrado que los agonistas del receptor de la vasopresina, gracias a su capacidad de vasoconstricción sistémica y mesentérica, son capaces de reducir la presión portal. En este sentido el segundo estudio de la presente tesis analiza el efecto de una nueva generación de agentes farmacológicos capaces de interactuar selectivamente con el receptor V1a de la vasopresina, en la vasodilatación esplácnica y en la hipertensión portal. Globalmente y según los resultados obtenidos en esta tesis doctoral, se puede concluir que la hipertensión portal puede ser tratada, en función del estadio de la enfermedad hepática, mediante dos novedosas y prometedoras estrategias terapéuticas. Por un lado, las CeO2NPs a través de sus efectos antioxidantes y antiinflamatorios pueden prevenir y/o reducir de forma secundaria la presión portal en animales con fibrosis compensada. Así es como la aplicación de la nanotecnología en el campo de la medicina podría ser una nueva estrategia para tratar en el futuro las enfermedades hepáticas crónicas. Por otra parte, en la cirrosis descompensada hay un aumento de los receptores V1a de la vasopresina a nivel esplácnico. El agonismo parcial de estos receptores permite reducir la hipertensión portal al tener un efecto vasoconstrictor en el mesenterio, movilizando el líquido intravascular hacia la circulación central e incrementando la excreción de sodio y agua.
Physiological conditioning of adult progenitor cells boosts cardiac regeneration = El condicionament fisiològic de cèl·lules progenitores adultes promou la regeneració cardíaca
(Universitat de Barcelona, 2016-01-29) Llucià Valldeperas, Aida; Bayés Genís, Antoni; Soler Botija, Carolina; Farré Ventura, Ramon; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[eng] The optimal cell lineage for cardiac regeneration remains elusive; and current treatments, with the exception of heart transplantation, are not enough to restore myocardial function. Thus, new strategies, such as cardiac tissue engineering, are now emerging as a new therapeutic modality. On the other hand, cardiac cells are normally subjected to electrical and mechanical forces that regulate gene expression and cellular function. Therefore, our hypothesis claims that in vitro individual or combined synchronous electro-mechanical stimuli mimicking the cardiac environment, could mature or induce cardiac differentiation on therapeutic cells to benefit further retention and integration into the myocardium. This thesis proposal had several goals: 1. Design an ad-hoc device to supply electrical and mechanical stimuli, individually or synchronously, to a monolayer cell culture. 2. Design a protocol for electrical, mechanical and electromechanical conditioning. 3. Analyze the cardiomyogenic effect of electrical, mechanical and electromechanical conditioning on adipose tissue-derived progenitor cells (ATDPCs) and cardiomyocyte progenitor cells (CMPCs). 4. Study the feasibility of a tissue engineered construct with trained cardiac adipose tissue-derived progenitor cells (cardiac ATDPCs). 5. Examine the regenerative capacity of electromechanically conditioned cardiac ATDPCs within a myocardial infarction murine model. Summing up, the conclusions derived from this thesis project are: 1. A new device for ad-hoc electrical and mechanical stimulation, individually or synchronously, has been developed in collaboration with the Electronic and Biomedical Instrumentation Group from the Universitat Politècnica de Barcelona. This device has been patented (WO 2013185818 A1) including some results obtained in this thesis. 2. Protocols for electrical, mechanical and electromechanical conditioning on cardiac ATDPCs culture were designed and optimized with the aim to mimic the cardiac environment. 3. Electrical stimulation on cardiac ATDPCs and CMPCs enhances the expression of cardiac transcription factors (MEF2A and GATA-4) crucial for cardiac differentiation. In addition, electrical conditioning promotes cardiac ATDPCs elongation and cell alignment. 4. Mechanical stimulation on cardiac ATDPCs upregulates cardiac transcription factors (GATA-4 and Tbx5) and structural genes (α-actinin and cTnI) expression, strongly dependent on the patterned surface. 5. In vitro electro-mechanical stimulation pre-commits the cell population against the hostile cardiac milieu through increased expression of cardiac transcription factors (Tbx5 and GATA-4), structural genes (b-MyHC) and, most importantly, calcium handling genes (Cx43 and SERCA2). 6. Conditioned cardiac ATDPCs fibrin constructs scarcely migrate to the murine myocardium, de novo express cTnI in vivo, increase vessel density and promote the sprouting of functional blood vessels, and improve cardiac function with only 105 implanted cells.
Deleció condicional de C/EBPß a les cèl·lules de la micròglia. Nova eina per a l'estudi i la modulació de l'activació glial en models de neurodegeneració
(Universitat de Barcelona, 2016-01-21) Pulido Salgado, Marta; Saura Martí, Josep; Solà i Subirana, Carme; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[cat] Treballs publicats recentment demostren que el factor de transcripció CCAAT/enhancer binding protein beta (C/ EBPbeta) regula l'activació microglial. Aquests resultats suggereixen que la inhibició de EBPbeta a les cèl.lules de la micròglia podria resultar neuroprotectora en trastorns del SNC on la inflamació crònica resulta ésser patològica. Amb l'objectiu de corroborar aquesta hipòtesi en models animals de neurodegeneració, durant el desenvolupament d'aquesta tesi doctoral s'ha generat la colònia LysMCre-C/ EBPbeta (fl/fl) amb deficiència selectiva de C/EBPbeta a les cèl.lules de la micròglia. Aquests animals són fèrtils, viables i l'estudi histològic no mostra cap alteració als òrgans i teixits, contràriament a allò observat als animals on el factor de transcripció ha estat eliminat a tots els tipus cel.lulars. Cultius primaris de micròglia mostren que la deleció de C/EBPbeta s'ha produït al 100% de les cèl.lules, mentre que l'expressió del factor de transcripció als astròcits no es veu alterada. La deleció de C/EBP8 a les cèl.lules microglials inhibeix la producció de NO alhora que augmenta la capacitat d'aquestes cèl.lules per a fagocitar i eliminar bacteris. A més, la seqüenciació de l'ARN de la micròglia primària mostra una gran afectació del transcriptoma d'aquest tipus cel.lular en resposta als tractaments amb LPS i LPS+IFNy. En aquestes mostres, la deleció de C/EBPbeta afecta l'expressió de 1068 gens involucrats principalment en les respostes inflamatòria i immune, fet que suggereix la implicació del factor de transcripció en aquests processos biològics. Per tal de corroborar aquests resultats en ratolins adults, s'ha aïllat la micròglia dels SNC d'aquests animals. Les dades obtingudes mostren que el 90% de les cèl.lules micròglials no expressen el factor de transcripció, alhora que l'expressió de gens proinflamatoris es veu clarament redu•la. Finalment, l'expressió de C/EBPbeta augmenta marcadament al model animal d'esclerosi múltiple, EAE, per aquesta raó s'ha induït la patologia als animals LysMCre- EBPbeta (fl/fl) ". Aquests ratolins mostren un retard en l'aparició dels primers símptomes, així com una marcada atenuació de la simptomatologia patològica. Així doncs, els resultats obtinguts en aquest treball demostren que C/EBPbeta és un factor clau en la regulació de l'activació microglial i que la seva inhibició resulta ésser una estratègia terapèutica.
La importancia del balance en ácidos grasos omega-3 y omega-6 en la esteatohepatitits no alcohólica asociada a la obesidad
(Universitat de Barcelona, 2015-12-15) López Vicario, Cristina; Clària i Enrich, Joan; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[spa] INTRODUCCIÓN: Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) son lípidos de membrana que confieren propiedades estructurales y fisiológicas a la célula. Los PUFA son considerados ácidos grasos esenciales porque nuestro organismo los obtiene a través de la dieta. Se clasifican en dos grandes famílias: omega-6 y omega-3. Ambas comparten 3 rutas biosintéticas para la formación de medidadores lipídicos de la inflamación: ciclooxigenasas, lipoxigenasas y citocromo P450 (CYP). La competencia existente entre los omega-6 y los omega-3 por las mismas vías puede generar desequilibrios metabólicos. Una relación omega-6/omega-3 elevada consecuente de un exceso de omega-6 en la dieta puede contribuir al desarrollo de enfermedades que cursan con inflamación. Los ratones fat-1 representan un modelo animal transgénico con una relación omega-6/omega-3 equilibrada debido a la presencia del gen fat-1 procedente del nematodo C. elegans. Este gen, ausente en mamíferos, codifica para la enzima omega-3 desaturasa que cataliza la conversión de los omega-6 en omega-3 permitiendo el enriquecimiento de los tejidos con omega-3. La enfermedad del hígado graso de origen no alcohólico (EHGNA) es un síndrome con etiología multifactorial que incluye un amplio espectro de anormalidades hepáticas que van desde la esteatosis hasta la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), y en algunos casos puede progresar a cirrosis hepática. La prevalencia de EGHNA está aumentando a nivel mundial paralelamente con el aumento de la obesidad. Desde que la obesidad es un problema emergente de salud pública, la identificación de nuevas estrategias terapéuticas es primordial para la prevención y el tratamiento de enfermedades metabólicas asociadas a la obesidad. OBJETIVOS: El objetivo esencial de este trabajo es investigar la efectividad de un balance equilibrado entre los PUFA omega-6 y omega-3 en la prevención de la EHGNA asociada a la obesidad mediante la utilización del modelo de ratón transgénico fat-1. RESULTADOS: Los resultados del primer estudio indican que el enriquecimiento tisular con omega-3 mediante la expresión transgénica del gen fat-1 representa efectos protectores frente a la EHNA. El restablecimiento del balance omega-6/omega-3 acompañado de intervenciones farmacológicas dirigidas a enzimas específicas delta-5/delta-6/delta-9 desaturasas producen un efecto protector sobre la esteatosis hepática y la inflamación. Los resultados del segundo estudio demuestran que la estabilización de los epóxidos derivados de los omega-3 generados a partir del CYP mediante la inhibición de la epóxido hidrolasa soluble (sEH) ejerce efectos beneficiosos en contrarrestar los desórdenes metabólicos asociados con la obesidad. Además, este estudio lanza más luz sobre el papel de la sEH en la homeostasis celular mostrando evidencias que los epóxidos de los omega-3 y la inhibición de la sEH regula la autofagia en los tejidos sensibles a la insulina, especialmente en el hígado. CONCLUSIÓN: Este proyecto de investigación pone de manifiesto que la modulación de la composición tisular en mediadores lipídicos derivados de los omega-3 para reestablecer el balance omega-6/omega-3 representa una estrategia prometedora en la prevención y la terapia de las comorbilidades relacionadas con la obesidad, como es el caso de la esteatohepatitis no alcohólica.
La proteïna adaptadora 3BP2 com a regulador de l’activitat cel·lular a través dels receptors de membrana FcεRI i KIT
(Universitat de Barcelona, 2014-03-20) Ainsua-Enrich, Erola; Martín Andorrà, Margarita; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[cat] Les molècules adaptadores són essencials en l'organització de les molècules de senyalització i en la coordinació i compartimentació de la seva activitat . 3BP2 és una proteïna adaptadora citoplasmàtica expressada ubiqüament però principalment en cèl·lules hematopoètiques. S'ha demostrat que actua com un regulador positiu transduïnt la senyal cel·lular en cèl·lules T , B i NK. 3BP2 és un important regulador en l’alliberació de grànuls citotòxics en les cèl·lules NK. Els mastòcits es desgranulen de manera similar després de l'agregació depenent d'antigen de l'alta afinitat del receptor per IgE (FceRI) a la superfície cel·lular. L'activació d'aquestes cèl·lules indueix l'alliberament de mediadors inflamatoris preformats i la síntesi de novo i també la secreció de citocines i quimiocines. El receptor KIT forma part dels receptors factors de creixement tirosin cinasa. El lligand de KIT és el SCF (stem cell factor), considerat com el factor de creixement més rellevant en mastòcits. L’activació de KIT a través del SCF és crucial per al desenvolupament, la diferenciació i la supervivència dels mastòcits, així com per a una òptima desgranulació depenent d'IgE i producció de citocines. En aquesta tesis s’estudia el paper del 3BP2 en la regulació de l’activitat cel·lular a través dels receptors de membrana, FcepcilonRI i KIT. Amb els resultats podem concloure que el 3BP2 és necessari per obtenir una òptima resposta del mastòcit, tan a nivell de les respostes immediates, com la desgranulació, com en les respostes tardanes com la secreció de IL-8 i de GM-CSF. En la transducció de senyals a traves del FceRI, el 3BP2 és un important regulador de l’activació de mastòcits humans. Per tant, 3BP2 podria ser una diana terapèutica potencial per les malalties inflamatòries mediades pels mastòcits dependents d'IgE. Per altre banda, el silenciament del 3BP2 redueix l’expressió del receptor KIT, tant en la superfície com a nivell transcripcional, això implica un paper del 3BP2 en aquest procés. De fet, el silenciament del 3BP2 condueix a una reducció de MITF, factor de transcripció implicat en l’expressió de KIT. Les mutacions d’activació en KIT s'han associat amb diverses malalties com la mastocitosi, per tant analitzem la capacitat de 3BP2 per regular l'expressió de KIT en la línia cel·lular HMC-1 on KIT es troba mutat. Trobem que el silenciament de 3BP2 en aquestes cèl·lules també redueix l’expressió de KIT. Curiosament el silenciament de KIT i la inhibició de l’activitat cinasa del receptor redueix l’expressió de 3BP2, tot això suggereix una estreta relació entre ambdues molècules. Per tant, 3BP2 podria ser una possible diana terapèutica, en malalties inflamatòries mediades per mastòcits i en trastorns on el KIT esta desregulat. Una d’aquestes malalties associades a la desregulació del receptor KIT son els tumors de cèl·lules de l'estroma gastrointestinal (GIST). La majoria dels GIST presenten mutacions en KIT (85%) o en el receptor PDGFRa (5%) que comporten un increment de l’activitat cinasa d’ambdós receptors. En el present treball es mostra que 3BP2 s'expressa en línies cel·lulars procedents de pacients amb GIST i que la reducció de l’expressió de 3BP2 indueix un decrement de l’expressió del KIT. Curiosament, el silenciament de 3BP2 també redueix l’expressió de PDGFRa. Per altre part, 3BP2 coprecipita amb els receptors KIT i PDGFRa indicant que la molècula pot ser mediador de la senyalització d’ambdós receptors. Aquests nous resultats destaquen la importància del 3BP2 en la regulació de l’expressió i senyalització d’aquests dos receptors oncogènics, mostrant un paper com a possible diana terapèutica en GIST, especialment rellevant en els casos de pacients que han adquirit resistència als inhibidors de l’activitat cinasa d’aquests receptors.
Cribratge biomecànic per a la identificació de potencials dianes en la fibrosi pulmonar
(Universitat de Barcelona, 2015-06-08) Giménez Hidalgo, Alicia; Alcaraz Casademunt, Jordi; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[cat] Nombroses malalties resulten d’una alteració de las propietats mecàniques dels teixits i/o d’una alteració en la resposta cel·lular a les forces (mecanotransducció). La fibrosi es el paradigma de la mecànica tissular alterada, caracterizant-se per una excessiva acumulació de matriu extracel·lular (MEC) que destrueix l’arquitectura de l’òrgan. La fibrosi pulmonar idiopàtica (FPI) és una forma de malaltia pulmonar intersticial (MPI) de causa desconeguda i molt mal pronòstic, amb una supervivència del 30-50% als 5 anys. En aquest treball s’ha desenvolupat una estratègia de cribratge biomecànic que s’ha aplicat l’estudi de la FPI per identificar gens mecanosensibles potencialment rellevants com a dianes terapèutiques. Es van cultivar fibroblasts pulmonars primaris, la cèl·lula responsable del remodelat i enduriment de la MEC, en substrats coberts de col·lagen I de 5 rigideses distintes al llarg del rang fisiopatològic del pulmó, des de la normal (<1 kPa) fins la pròpia de la fibrosi (~30-40 kPa) i en presència de TGF-β. Es van incloure 3 classes de fibroblasts: FPI, control i MPI distintes de la FPI i es va realitzar un perfilat transcripcional mitjançant microarrays d’expressió. S’ha definit el mecanotranscriptoma dels fibroblasts pulmonars, format per 63 gens mecanosensibles, la transcripció dels quals està controlada pels canvis en les propietats mecàniques de la MEC. Un 57% dels gens van ser sobreexpressats amb l’enduriment i 21 gens van discriminar entre la FPI i las altres dos classes de fibroblasts. Para entendre las xarxes reguladores associades al mecanotranscriptoma, es va construir l’interactoma dels seus components, el qual va revelar tres xarxes emergents, les quals poden ser rellevants per entendre l’adaptació de les cèl·lules a l’enduriment del substrat en la FPI i en la mecanobiologia en general: 1) elements del citoesquelet i les fibres d'estrés, 2) quinases MAPK i les seves fosfatases i 3) proteïnes relacionades amb el factor de creixement similar a la insulina (IGF) i proteases del sistema de fibrinòlisi. Després de validar l’expressió a nivell de mRNA i de proteïna de diversos candidats del mecanotranscriptoma, es van caracteritzar diversos aspectes de la proteïna d’unió al factor de creixement similar a la insulina 3 (IGFBP-3). La concentració d’IGFP-3 secretada pels fibroblasts va ser distintivament superior en els fibroblasts de FPI. Per altra banda, amb l’enduriment del substrat es va detectar un factor de mecanosensibilitat de l’odre 3X en totes les classes de fibroblasts, mentre que el TGF-β la va induir 150 vegades. L’efecte dels dos factors va ser independent, mentre que la seva combinació va potenciar sinèrgicament els nivells d’IGFBP-3. L’efecte de la duresa del substrat en l’acumulació d’IGFBP-3 va ser independent de la senyalització a través del receptor de TGF-β. Per altra banda, els efectes van ser dependents del receptor de col·lagen integrina β1. Aquests resultats mostren que la IGFBP-3 es una proteïna important en la fibrogènesi pulmonar mediada por l’enduriment, que portaria a una acumulació de MEC i a la destrucció de l’arquitectura del teixit.
Reconstrucción y cuantificación de estudios SPECT en animal pequeño
(Universitat de Barcelona, 2014-10-21) Pino Sorroche, Francisco; Ros Puig, Domènec; Pavía Segura, Javier; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[spa] Los sistemas SPECT de animal pequeño alcanzan una resolución espacial inferior al milímetro. Para conseguirlo, es necesario utilizar colimadores pinhole, ya que la imagen del objeto proyectada en la gammacámara a través del pequeño orificio del colimador puede estar ampliada respecto al objeto. Con el fin de optimizar el proceso de reconstrucción y obtener resoluciones submilimétricas utilizando equipos de pequeño formato equipados con un colimador pinhole, es necesario utilizar métodos de reconstrucción iterativos. Estos algoritmos ofrecen una calidad de imagen superior y una mejor exactitud en la cuantificación que los métodos de reconstrucción analíticos, al poder corregir las diferentes degradaciones sufridas en el proceso de formación de la imagen. A continuación se detalla el trabajo desarrollado y los principales resultados obtenidos para conseguir este objetivo: 1. Implementación de un programa de calibración para calcular los parámetros geométricos que describen la adquisición de un equipo SPECT equipado con colimador pinhole. 2. Desarrollo de un algoritmo de reconstrucción iterativa OSEM para la reconstrucción de estudios SPECT con colimador pinhole. 3. Adaptación el algoritmo de reconstrucción y el programa de calibración a un equipo SPECT con colimador pinhole de pequeño formato desarrollado en nuestro centro. La resolución tomográfica del equipo fue de 1 mm para radios de adquisición pequeños. Las imágenes reconstruidas de estudios en ratones muestran la viabilidad del equipo para su utilización con pequeños animales. 4. Incorporación en la matriz de transición del sistema la geometría del sistema, la penetración septal a través del colimador y la respuesta del detector. La resolución, el contraste y los coeficientes de recuperación mejoran al incorporar la penetración septal respecto a la modelización geométrica, aunque la mejora más importante se obtuvo al incluir la respuesta del detector. El número de iteraciones utilizadas en la reconstrucción debe limitarse para evitar la aparición de artefactos de anillo. Estos artefactos son de mayor importancia cuando la modelización del sistema incorpora la geometría, la penetración septal y la respuesta del detector. 5. Comparación del algoritmo de reconstrucción desarrollado con un algoritmo de reconstrucción que calcula la matriz de transición con técnicas de Monte Carlo. El tiempo de cálculo de la matriz de transición del sistema con la aproximación analítica fue tres órdenes de magnitud inferior al de la aproximación por Monte Carlo. La resolución y el contraste de las imágenes reconstruidas mediante ambas aproximaciones fueron similares. Las imágenes reconstruidas con el modelo Monte Carlo presentaban una relación señal/ruido sensiblemente más baja, posiblemente asociada a problemas de precisión en el cálculo de los elementos de matriz por la utilización de un número insuficiente de historias de fotones en el cálculo.
Papel del receptor nuclear PPARgamma en la inflamación y la esteatosis hepática
(Universitat de Barcelona, 2013-09-13) Moran Salvador, Eva; Clària i Enrich, Joan; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[spa] El receptor nuclear PPARgamma controla y regula variedad de procesos biológicos como la adipogénesis, respuestas inflamatorias, y la homeostasis de los carbohidratos y lípidos. En relación con la EHGNA, el aumento de expresión de PPARgamma es una característica general de la esteatosis hepática demostrada tanto en estudios clínicos como en experimentales. Aunque se ha demostrado que la administración de TZDs mejora la esteatosis hepática en pacientes con EHGNA. En el contexto de la inflamación y fibrosis hepática no se ha establecido el papel que ejerce PPARgamma. Se han descrito las funciones antiinflamatorias que puede ejercer PPARgamma modulando el estado de activación de los macrófagos. Por otro lado, múltiples publicaciones demuestran que la recuperación de la expresión de PPARgamma en las células hepáticas estrelladas (CHE) revierte el estado de activación característico de la fibrosis hacia el de quiescencia. No obstante, otros estudios muestran resultados opuestos considerando que las acciones antiinflamatorias de las TZDs pueden ser limitadas, no aplicables para todas las fases de la EHGNA y actuar de forma independiente a la activación de PPARgamma. Debido que a PPARgamma se le han atribuido funciones controvertidas sin definir sus funciones exactas en los estadios de la enfermedad hepática, el objetivo principal de la tesis fue determinar cómo contribuye la expresión de PPARgamma de las células del parénquima y sinusoide hepático en la patogénesis de la EHGNA. Para ello, hemos utilizado la tecnología Cre-LoxP para generar modelos genéticos (ratones knockout o KO condicionales) en los que se ha eliminado selectivamente el gen para PPARgamma de forma específica en hepatocito, en macrófago así como en las células de Kupffer (CK) y en CHE. El primer estudio proporciona evidencias que PPARgamma es un factor pro-esteatótico en los hepatocitos y su expresión contribuye en la progresión del hígado graso inducido por la obesidad. La eliminación del gen para este receptor nuclear en los hepatocitos, y en menor medida en los macrófagos, protege a los ratones frente al modelo de obesidad y esteatosis inducido por una dieta rica en grasa. Los experimentos in vitro en cultivos de cortes de alta precisión de hígado (CAPH) y cultivos primarios de hepatocitos demostraron que el agonista de PPARgamma (rosiglitazona) induce la acumulación intrahepática de triglicéridos, un efecto que fue bloqueado por el antagonista de PPARgamma BADGE. Finalmente, observamos que los hepatocitos y los cultivos de CAPH de ratones deficientes para PPARgamma en hepatocitos presentaron una respuesta mitigada frente al estímulo proesteatotico de ácido oleico. En el segundo estudio se examinó el papel específico de PPARgamma en la respuesta aguda y crónica frente un agente hepatotóxico (CCl4). Se observó que la deleción de PPARgamma en los macrófagos y CK origina una respuesta inflamatoria exacerbada que conduce a la acentuación del daño hepático y la fibrogénesis. Estos hechos se confirmaron in vitro en cultivos de CAPH de los ratones control y deficientes para PPARgamma en los macrófagos/CK tras someterlos a un estímulo inflamatorio agudo con LPS. Curiosamente, los ratones KO condicionales en los hepatocitos mostraron menor daño hepático frente al modelo crónico de CCl4, y se observó una protección parcial frente el daño agudo hepático a través de CCl4 o el estímulo con LPS en cultivos de CAPH. Al evaluar la respuesta de los ratones KO condicionales en las CHE frente al modelo crónico de daño hepático se observó daño hepático exacerbado y una respuesta fibrogénica agravada, por lo que la expresión de PPARgamma en las CHE también ejerce un papel antifibrótico importante. En conclusión, nuestros hallazgos sugieren la existencia de roles divergentes específicos de célula e incluso funciones opuestas para PPARgamma en la patogénesis de la EHGNA y el daño hepático.
Caracterització del contingut proteic del nucli de l’espermatozoïde humà i el seu potencial epigenètic
(Universitat de Barcelona, 2014-09-19) Castillo Corullón, Judit; Oliva Virgili, Rafael; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[cat] L’espermatozoide és una cèl•lula molt especialitzada amb una estructura de la cromatina única formada per dos dominis principals: el domini nucli-protamínic on la gran majoria del DNA es troba empaquetat per protamines en toroides molt compactes, i el domini nucli-histònic on una petita proporció del DNA roman empaquetat per histones, d’una manera més accessible. Cada vegada són més les evidències que suggereixen que l’espermatozoide madur presenta una funció més enllà de la simple transmissió del material genètic patern a la següent generació. La hipòtesi principal d’aqueta tesi consisteix en que aquesta contribució paterna no és solament basada en la transmissió de patrons de metilació de DNA o modificacions d’histones concretes, si no que també es troba influïda per l’estat de la cromatina espermàtica i, en especial, per la seva composició proteica. Per aquest motiu, en aquesta tesi doctoral s’ha caracteritzat detalladament el contingut proteic del nucli de l’espermatozoide humà normal mitjançant dues estratègies diferents. Per una banda, les proteïnes majoritàries del nucli espermàtic, les protamines, han sigut analitzades per extraccions i electroforesis àcides per tal d’estudiar la seva implicació en la conservació de la cromatina. S’ha observat una relació negativa significativa entre la quantitat de protamines i el dany al DNA espermàtic (mesurat per la tècnica COMET) en pacients infèrtils que cursen tècniques de reproducció assistida. Aquests resultats han suggerit una funció de les protamines referent a la protecció del material genètic patern. A més a més, mitjançant tècniques basades en espectrometria de masses (Top-down proteomics), s’ha observat com les protamines podrien contenir modificacions post-traduccionals en la seva seqüència (fosforilacions, acetilacions, metilacions), el que suggeriria també una funció reguladora per aquestes proteïnes espermàtiques. En segon lloc, mitjançant espectrometria de masses també s’han caracteritzat la resta de proteïnes presents en el nucli del gàmeta masculí madur. S’han arribat a identificar centenars de proteïnes, la meitat de les quals corresponen a histones, variants d’histones, modificadors d’histones, factors de transcripció, proteïnes addicionals associades a la cromatina i proteïnes modificadores de la cromatina espermàtica. D’aquesta manera, mitjançant anàlisis bioinformàtics es pot observar com el nucli de l’espermatozoide humà madur es trobaria enriquit en proteïnes involucrades en processos reguladors com la modificació de la cromatina, modificació d’histones, expressió gènica i transcripció. Aquestes tendències també es trobarien presents en altres espècies de mamífers, com per exemple el ratolí, la rata o el macaco. La presència d’aquests grups de proteïnes intactes en una cèl•lula considerada transcripcionalment inerta ha suggerit una funció epigenètica/reguladora durant els primers estadis del desenvolupament embrionari. Addicionalment, en aquesta tesi doctoral s’ha observat que les proteïnes espermàtiques nuclears es poden diferenciar en dos grups diferents segons la seva afinitat per la cromatina espermàtica. D’aquesta manera, les proteïnes unides més fortament al DNA es trobarien majoritàriament implicades en funcions estructurals, mentre que les proteïnes unides al DNA d’una forma més feble es trobarien relacionades amb processos reguladors o epigenètics. Aquesta observació, juntament amb el fet conegut de que la regió més accessible de la cromatina espermàtica (associada a les histones) es troba especialment enriquida en promotors i gens del desenvolupament, suggeriria que part de les proteïnes nuclears espermàtiques podrien estar relacionades amb la regulació de la transcripció d’aquests gens, a més a més d’altres processos com la remodelació de la cromatina en el pronucli masculí. Per tant, mitjançant la caracterització del contingut proteic del nucli de l’espermatozoide humà, s’ha augmentat el coneixement d’aquesta cèl•lula i de la seva funcionalitat, recolzant la hipòtesi de que a més a més del propi material genètic patern, l’espermatozoide contribueix en la fertilització amb informació epigenètica, la qual inclou una composició proteica específica de la cromatina.
Mecanismes moleculars de secreció miocardíaca: remodelat ventricular i secreció de pèptid natriurètic tipus B
(Universitat de Barcelona, 2013-02-19) Casals Mercadal, Gregori; Jiménez Povedano, Wladimiro; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[cat] PART 1. EFECTE DE LA HIPÒXIA I FACTORS POINFLAMATORIS SOBRE EL REMODELAT CARDÍAC EN CARDIOMIÒCITS VENTRICULARS HUMANS. INTRODUCCIÓ. Els mecanismes moleculars pels quals la isquèmia miocardíaca es tradueix en remodelat ventricular i insuficiència cardíaca són poc coneguts. HIPÒTESI. La hipòxia i factors proinflamatoris són inductors específics de recanvi de matriu extracel•lular en els cardiomiòcits humans. MÈTODES. Cardiomiòcits ventriculars humans adults (cèl•lules AC16) van ser incubats en condicions de tensió reduïda d’oxigen, CoCl2 (activador del factor de transcripció induïble per hipòxia 1, HIF-1), rotenona (inhibidor de HIF-1), TNFα, IL1β, LPS o vehicle durant intervals de temps variables. Un cop completats els períodes d’incubació, van obtenir-se els sobrenadants i el RNA cel•lulars per determinar la secreció cel•lular i l’expressió gènica de factors relacionats amb el recanvi de matriu extracel•lular. RESULTATS. La hipòxia indueix la producció de PIIINP (propèptid aminoterminal del del procolàgen tipus III) i inhibeix la síntesi i producció de TIMP1 (inhibidor tissular de metaloproteinases tipus 1) en els cardiomiòcits. La IL1β estimula la producció de PIIINP, TIMP1 i àcid hialurònic en cardiomiòcits. CONCLUSIÓ. La hipòxia i la IL1β activen el remodelat de matriu extracel•lular en cardiomiòcits ventriculars humans. Els resultats suggereixen que la hipòxia i la IL1-β són factors contribuents a la dilatació ventricular i insuficiència cardíaca en la malaltia cardíaca isquèmica. PART 2. EFECTE DE LA HIPÒXIA SOBRE LA SECRECIÓ DEL PÈPTID NATRIURÈTIC TIPUS B (BNP) EN CARDIOMIÒCITS VENTRICULARS HUMANS. INTRODUCCIÓ. El principal estímul per la síntesi i secreció de BNP es la distensió de la paret cardíaca. Evidències recents suggereixen que la isquèmia cardíaca pot induir també la producció de BNP. HIPÒTESI. La tensió reduïda d’oxigen estimula directament l’expressió gènica i la secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars humans en absència d’estímuls hemodinàmics o neurohormonals. MÈTODES. Cardiomiòcits ventriculars adults (cèl•lules AC16) van ser incubats en condiciones normòxiques o hipòxiques amb o sense la presència de rotenona. L’acumulació de BNP, ANP i VEGF es va mesurar en els sobrenadants cel•lulars. L’expressió gènica d’aquests factors va determinar-se mitjançant PCR a temps real. L’activitat transcripcional de HIF-1 va determinar-se en extractes nuclears cel•lulars mitjançant un enziminmunoassaig lligat a la seqüència d’unió de HIF-1 al DNA. RESULTATS. L’activitat transcripcional de HIF-1 va induir-se en condicions hipòxiques. La hipòxia va estimular la secreció i l’expressió gènica de BNP i VEGF però no d’ANP en els cardiomiòcits. La inhibició de HIF-1 en condicions hipòxiques va disminuir la secreció de BNP i VEGF. CONCLUSIONS. La hipòxia indueix la síntesi i secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars humans a través d’un mecanisme depenent de l’activació transcripcional de HIF-1. PART 3. ESTUDI DE LA SIGNIFICACIÓ CLÍNICA DE LES CONCENTRACIONS PLASMÀTIQUES DE BNP A L’INGRÉS EN PACIENTS AMB SÍNDROME CORONÀRIA AGUDA (SCA). INTRODUCCIÓ. Els pacients SCA presenten concentracions plasmàtiques elevades de BNP atribuïdes a la distensió de la paret ventricular. Existeix poca informació sobre el valor clínic d’aquest marcador cardíac en pacients amb SCA i fracció d’ejecció ventricular esquerra (LVEF) preservada. La demostració que la hipòxia estimula directament la secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars permet formular la hipòtesi que els pacients amb SCA sense insuficiència cardíaca i/o disfunció ventricular presenten concentracions plasmàtiques de BNP elevades, en relació al grau d’hipòxia cel•lular. Mètodes. L’estudi es va realitzar en 1806 pacients amb SCA ingressats de forma consecutiva dins les primeres 24 hores posteriors a l’inici dels símptomes. Es va realitzar un seguiment durant un any de l’aparició d’esdeveniments adversos. RESULTATS. La concentració plasmàtica de BNP en els pacients amb SCA i LVEF preservada va ser superior a l’observada en un grup control d’individus sans. Durant el seguiment, l’aparició d’esdeveniments adversos va ser del 10,0% en els pacients amb LVEF reduïda i del 7,9% en els pacients amb LVEF preservada. Els pacients amb BNP>150 pg/ml van presentar una major probabilitat d’esdeveniments adversos. L’anàlisi estadístic multivariat mostra que la contribució de BNP en la predicció d’esdeveniments adversos es manté desprès d’ajustar en funció de la LVEF. CONCLUSIONS. Els pacients amb SCA i LVEF preservada presenten concentracions plasmàtiques de BNP elevades a l’ingrès, que constitueixen un factor predictor independent de presentar nous episodis de SCA i/o mortalitat.
Study of the diffusive properties of extracellular matrix gels used in 3D cultures
(Universitat de Barcelona, 2013-12-03) Galgoczy, Roland; Alcaraz Casademunt, Jordi; Reguant Aransay, Noemi; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[spa] Tradicionalmente, las células han sido cultivadas en placas Petri en un entorno bidimensional por más de un siglo. Sin embargo, las células de un organismo vivo tienen un entorno tridimensional. Todas las células del tejido se unen a una matriz extracelular (ECM). Además, la difusión y la vinculación de muchas proteínas tales como factores de crecimiento, está regulada por la matriz 3D. El reconocimiento del importante papel regulador de la ECM in vivo ha extendido los usos de los cultivos en 3D basados en el crecimiento de las células dentro de geles con componentes nativos de ECM . El objetivo general de esta tesis fue estudiar las características de los cultivos celulares tridimensionales de matriz extracelular más comunes en términos de difusión. Los resultados ilustran que la relación de Stokes-Einstein derivada para fluidos newtonianos puede extenderse a la compleja estructura enmarañada de geles de ECM para partículas esféricas mucho más pequeñas que el tamaño de poro medio de la ECM. Además, el impedimento a la difusión (tortuosidad) en geles de ECM está dominada por factores no-geométricos hidrodinámicos (es decir, viscosidad ECS) en lugar de las propiedades geométricas (estérica) del gel tal y como se asume en la literatura. Los cultivos en 3D basados en geles densos (3 mg/ml) son sustitutos adecuados de los tejidos en términos de difusión y son incluso capaces de reproducir la tortuosidad fisiológica extrema del tejido cerebral. Estos resultados apoyan que la ECM es un importante aporte a la tortuosidad del tejido, particularmente en grandes densidades de ECM y se destaca la importancia de utilizar los portadores con baja RH en la entrega de fármacos. Se han proporcionado las primeras mediciones del consumo de oxígeno en células A549 en cultivos 3D, las cuales han revelado un efecto dominante de la composición de ECM sobre la densidad en el consumo de oxígeno. Las predicciones de modelos pueden ser útiles como puntos de partida para el grosor y la densidad celular inicial en los estudios de cultivos 3D, reduciendo así la optimización inicial. Muchos de los efectos no deseados de difusión pueden ser superados mediante simples modificaciones experimentales como el espesor del gel o la densidad de siembra inicial.
Efecte de l'activació del canal K(ATP) al perfil d'expressió microglial durant la neurodegeneració a l'hipocamp de la rata
(Universitat de Barcelona, 2013-04-26) Martinez Moreno, Margot; Rodríguez Allué, Manuel José; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[cat] En aquesta tesi s'ha estudiat l'efecte de l'activació del canal de potassi dependent de ATP (KATP) amb un fàrmac activador, la diazoxida, sobre el perfil fenotípic de la microglia en dos models diferenciats: un de in vitro amb una línia cel•lular i un de in vivo en un model de lesió excitotòxica a l'hipocamp de la rata. També s'ha estudiat com aquesta modulació afecta a la progressió de la lesió excitotòxica i la neurogènesis que porta associada. Finalment, s'ha descrit la presència del canal de calci dependent de voltatge (VGCC) a microglia i com la seva inhibició també regula la activitat microglial in vivo i in vitro.
Estratègies de diagnòstic genètic en fetus amb malformacions congènites. Correlació genotip-fenotip
(Universitat de Barcelona, 2013-07-10) Mademont Soler, Irene; Sánchez Díaz, Aurora; Oliva Virgili, Rafael; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[cat] Les alteracions cromosòmiques constitucionals representen una de les principals causes d’anomalies congènites a la població, i el seu diagnòstic durant l’etapa prenatal és el principal objectiu de la majoria de procediments invasius que es realitzen durant l’embaràs. Actualment, el cariotip convencional és el gold standard del diagnòstic citogenètic prenatal, però els avanços tecnològics dels últims anys han portat al desenvolupament de tècniques de citogenètica molecular que ofereixen característiques molt atractives, la principal de les quals és l’elevada resolució. Donat que el paper que han de tenir aquestes tècniques durant l’etapa prenatal encara no està ben definit, els objectius de la present tesi han estat: a) determinar el potencial diagnòstic i la utilitat del cariotip i les tècniques de citogenètica molecular Fluorescent In Situ Hybridization (FISH), Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) i Chromosomal Microarray-based Analysis (CMA) en diagnòstic prenatal, especialment per a l’estudi de gestacions amb troballes ecogràfiques; i b) valorar la necessitat de modificar els procediments actuals de diagnòstic citogenètic prenatal. En primer lloc, s’han revisat els resultats dels 29.883 cariotips en líquid amniòtic realitzats entre 1998 i 2009 a l’Hospital Clínic de Barcelona. Els resultats obtinguts corroboren que el cariotip és una eina efectiva i robusta per a l’obtenció del cariotip fetal, revelant alteracions cromosòmiques en el 2,9% de les gestacions que es sotmeten a un procediment invasiu. La translucidesa nucal incrementada i les anomalies ecogràfiques destaquen com a indicadors excel•lents d’anomalia cromosòmica. En segon lloc, s’ha avaluat la utilitat de l’MLPA subtelomèrica per a l’estudi de gestacions amb troballes ecogràfiques i cariotip normal. Dels 229 fetus analitzats, 3 presentaven desequilibris subtelomèrics críptics (1,3%). Donat que la freqüència d’aquests desequilibris és baixa, i a més la correlació genotip-fenotip observada és pobra, l’MLPA subtelomèrica no sembla ser una eina crucial per a l’estudi d’aquestes gestacions. D’altra banda, s’ha estudiat la idoneïtat de reemplaçar els estudis de FISH de la regió 22q11.2 per kits d’MLPA dissenyats per a l’estudi d’aquesta regió i altres regions genòmiques associades a cardiopaties. S’han analitzat mitjançant aquests kits 55 gestacions amb troballes cardíaques, cariotip normal i estudi de FISH negatiu per a la microdeleció típica de 22q11.2, i no s’ha detectat cap anomalia. Aquest fet, juntament amb que l’MLPA presenta una taxa de repetició i de no obtenció de resultats superiors a la FISH, i que generalment requereix cultiu cel•lular, indica que la FISH hauria de seguir sent la tècnica d’elecció per a l’estudi de fetus amb troballes cardíaques (enfront l’MLPA). També s’ha volgut determinar la freqüència dels diferents tipus d’alteracions cromosòmiques, tant microscòpiques com críptiques, en fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques. L’anàlisi retrospectiu dels resultats obtinguts en el període 2009-2011 a l’Hospital Clínic de Barcelona en aquest grup de gestacions (N=276) ha revelat una freqüència d’anomalies cromosòmiques microscòpiques i casos de Síndrome de la deleció cromosòmica 22q11.2 del 15,9% i 6,4%, respectivament; uns resultats que corroboren la forta associació existent entre troballes ecogràfiques cardíaques i anomalies cromosòmiques. A més, aquesta associació varia significativament en funció del tipus de troballa ecogràfica cardíaca i de la presència d’anomalies extracardíaques. D’altra banda, s’han analitzat mitjançant array CGH 51 fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques, cariotip normal, i sense estudi o resultat de FISH negatiu per a la Sd. de la deleció cromosòmica 22q11.2. En aquest grup de gestacions, la taxa de detecció de variants en número de còpia patogèniques ha estat del 2%, i no s’han detectat variants de significat clínic incert. Si en la nostra sèrie de 276 gestacions amb troballes ecogràfiques cardíaques s’hagués utilitzat l’estratègia QF-PCR + CMA enlloc de cariotip, totes les anomalies cromosòmiques amb repercussió clínica clara diagnosticades per citogenètica convencional s’haguessin identificat, s’haguessin detectat els casos de delecions de 22q11.2, i s’hagués incrementat un 2% el nombre de casos diagnosticats. Per tant, aquests resultats mostren el potencial de les plataformes de microarray per al diagnòstic prenatal de fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques. Finalment, s’han utilitzat les tècniques de citogenètica molecular FISH, MLPA i/o CMA per a la caracterització de 6 alteracions cromosòmiques visibles al cariotip però de difícil caracterització per citogenètica convencional. En tots els casos, la utilització d’aquestes tècniques ha contribuït a la correcte descripció de l’alteració identificada, posant de manifest la seva utilitat quan s’utilitzen de forma complementària al cariotip. L’elaboració d’aquesta tesi i la literatura recentment publicada evidencien la necessitat d’un nou plantejament dels protocols clínics de diagnòstic citogenètic prenatal, especialment en relació a la utilització de plataformes de microarray en diagnòstic prenatal
Anàlisi del contingut de RNA i estudi mutacional de gens candidats en iinfertilitat masculina
(Universitat de Barcelona, 2012-07-22) Jodar Bifet, Meritxell; Oliva Virgili, Rafael; Oriola Ambrós, Josep; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[cat]La infertilitat és un problema que cada cop és més comú en la població actual. S’ha definit que la meitat dels casos de la infertilitat es deu a un factor masculí, no obstant, la gran majoria segueix sent d’etiologia desconeguda. Els grans objectius d’aquesta tesi es poden dividir en dos camps: (i) la cerca de factors genètics que puguin ser causa de la infertilitat masculina i (ii) la cerca de nous factors, com els RNAs i miRNAs, que puguin aclarir la patogenicitat de tipus determinats de infertilitat i el seu futur ús com a biomarcadors de la fertilitat.
Physical forces and mechanical waves during tissue growth
(Universitat de Barcelona, 2013-04-05) Serra Picamal, Xavier; Trepat Guixer, Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
----
Hepatic remodeling, serum biomarkers and prevention of fibrosis progression in liver disease
(Universitat de Barcelona, 2012-12-11) Reichenbach Marinkovic, Vedrana; Jiménez Povedano, Wladimiro; Biochemical markers; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[eng] Hepatic fibrosis is characterized by intense tissue remodeling. In this study, we assessed whether CO3-610, a new identified neoepitope, could be used as a surrogate biomarker of liver fibrosis and portal hypertension in CCl4-induced experimental fibrosis. Serum CO3-610 was measured by ELISA. Liver fibrosis was quantified by Sirius red staining. Serum hyaluronic acid (HA) was measured with a binding-protein assay. Gene expression of collagens I and III, MMP2 and MMP9, and tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 1 and 2 was quantified by PCR. Hemodynamic measurements were taken in a subgroup of animals. A close direct relationship was found between serum CO3-610 and hepatic collagen content (r= 0.78; P<0.001), superior to that found for serum HA (r= 0.49; P<0.05). CO3-610 levels in rats with severe fibrosis (43.5±3.3 ng/mL, P<0.001) and cirrhosis (60.6±4.3 ng/mL, P<0.001) were significantly higher than those in control animals (26.6±1.3 ng/mL). Importantly, a highly significant relationship was found between serum CO3-610 and portal hypertension (r= 0.84; P<0.001). Liver MMP9 expression increased significantly in fibrotic animals but decreased to control levels in cirrhotic ones. Circulating CO3-610 behaves as a reliable indicator of hepatic remodeling and portal hypertension in experimental fibrosis. Therefore, this peptide could ultimately be a useful marker for the management of liver disease in patients. Endocannabinoids behave as antifibrogenic agents by interacting with cannabinoid CB2 receptors, whereas the apelin (AP) system acts as a proangiogenic and profibrogenic mediator in the liver. This study assessed the effect of long-term stimulation of CB2 receptors or AP receptor (APJ) blockade on fibrosis progression in rats under a non-discontinued fibrosis induction program. The study was performed in control and CCl4-treated rats for 13 weeks. Fibrosis-induced rats received a CB2 receptor agonist (AM1241) (1 mg/kg), an APJ antagonist (F13A) (75 μg/kg), or vehicle daily during the last 5 weeks of the CCl4 inhalation program. Mean arterial pressure (MAP), portal pressure (PP), hepatic collagen content, angiogenesis, cell infiltrate, and mRNA expression of a panel of fibrosis-related genes were measured in all animals. Fibrosis-induced rats showed increased hepatic collagen content, reduced MAP, PP, and increased expression of the assessed messengers in comparison with control rats. However, fibrotic rats treated with either AM1241 or F13A had reduced hepatic collagen content, improved MAP and PP, ameliorated cell viability, and reduced angiogenesis and cell infiltrate compared with untreated fibrotic rats. These results were associated with attenuated induction of PDGFRβ, α-SMA, MMPs, and TIMPs. CB2 receptor stimulation or APJ blockade prevents fibrosis progression in CCl4-treated rats. The mechanisms underlying these phenomena are coincident despite the marked dissimilarities between the CB2 and APJ signaling pathways, thus opening new avenues for preventing fibrosis progression in liver diseases. PDGF is the most potent stimulus for proliferation and migration of stellate cells. PDGF receptor β expression is an important phenotypic change in myofibroblastic cells that mediates proliferation and chemotaxis. Here we analyzed the relationship between PDGFRβ expression, hemodynamic deterioration, and fibrosis. Thereafter, we investigated the effects produced by an adenovirus encoding a dominant-negative soluble PDGFRβ (sPDGFRβ) on hemodynamic parameters, PDGFRβ signaling pathway, and fibrosis. Hemodynamics, PDGFRβ mRNA expression, and hepatic collagen were assessed in controls and fibrosic/cirrhotic rats. Next, 30 fibrotic rats were randomized into three groups receiving iv saline and an adenovirus encoding for sPDGFRβ or β-galactosidase. After 7days, hemodynamics, serum sPDGFRβ, and hepatic collagen were measured. CCl4-treated animals for 18weeks showed a significantly higher increase in PDGFRβ mRNA compared to those treated for 13weeks and control rats. In CCl4-treated rats, the fibrous tissue area ranged from moderate to severe fibrosis. A direct relationship between the degree of fibrosis, hemodynamic changes, and PDGFRβ expression was observed. Fibrotic rats transduced with the adenovirus encoding sPDGFRβ showed increased MAP, decreased PP, lower activation of the PDGFRβ signaling pathway, and reduced hepatic collagen than fibrotic rats receiving β-gal or saline. PDGFRβ activation closely correlates with hemodynamic disorders and increased fibrosis in CCl4-treated rats. Adenoviral dominant negative soluble PDGFRβ improved fibrosis. As a result, the hemodynamic abnormalities were ameliorated. Cirrhotic patients have altered host-defense response mechanisms. Here we assessed whether impaired expression of CB2 receptor in monocytic cells of cirrhotic patients could be involved in the pathogenesis of this phenomenon. CB2 mRNA and protein expression was assessed in a differentiated human monocytic cell line (U937) stimulated with endotoxin (LPS). A PCR array of 86 different genes was assessed in U937 cells treated with LPS. A migration assay towards endocannabinoids or the CB2 antagonist, SR144528, was performed in U937 cells exposed to LPS. Finally, CB1 and CB2 mRNA expression were measured in monocytes and macrophages of cirrhotic patients with or without spontaneous bacterial peritonitis. LPS reduced CB2 expression in human monocytes. Endocannabinoids increased the migratory activity of U937 cells, which was reverted when the experiments were performed in the presence of LPS. Transcriptional profiling showed marked upregulation of 9 genes related to proinflammatory signaling. However, only two genes encoding for CB1 and CB2 were reduced in LPS-treated cells. Circulating monocytes of cirrhotic patients showed a significantly diminished mRNA expression of CB1 and CB2. Markedly low CB1 and CB2 mRNA levels were found in peritoneal macrophages of cirrhotic patients with ascites, being almost suppressed when analyzed in patients with peritonitis. LPS reduces CB2 expression in human monocytes resulting in depressed chemotactic activity and therefore impaired host defense response of these cells.
TGF-ß-regulated genes implicated in invasion that might participate in the control of apoptosis in liver tumor cells
(Universitat de Barcelona, 2012-05-16) Mainez Villoro, Jessica; Fabregat Romero, Isabel; Fabra Fres, Àngels; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[eng] In the last years our research has been focused on analyzing the signaling pathways induced by TGF-β in liver tumor cells, to understand the molecular mechanisms that confer resistance to its suppressor effects. TGF-β induces apoptosis in fetal and neonatal murine hepatocytes, as well as in liver tumor cells, and chronic exposure of these cells to TGF-β iinduces a process of Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT). In the present work we wanted to identify TGF-β-regulated genes that being involved in EMT and cell invasion could also participate in the control of growth, apoptosis and/or differentiation. Firstly we analyzed the role of genes regulated by TGF-β and implicated in EMT that might participate in apoptosis control in hepatocytes, focusing on Snail and SPARC. Inhibition of Snail, through targeting knock-down with specific siRNA, impairs TGF-β-induced EMT in murine hepatocytes and significantly enhances their apoptotic response, which indicates that Snail plays a relevant role in conferring resistance to TGF-β-induced cell death. TGF-β also induces anti-apoptotic signals, mediated by the activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR). Snail downregulation impairs the TGF-β-induced EGFR ligands expression and inhibits the phosphorylation of Akt, Erks and c-Src family, which is coincident with activation of mitochondrial-dependent apoptotic events and an earlier Smad3 phosphorylation in TGF-β-treated cells. We also demonstrate a role for Snail in sensitizing murine hepatocytes to cell death by anoikis, which is a relevant phenomenon in metastatic processes. Snail1 downregulation in human hepatocellular carcinoma (HCC) cells, which are partially or fully resistant to TGF-β suppressor effects, restores the apoptotic response to TGF-β. TGF-β induces SPARC expression in FaO rat liver tumor cells but not in neonatal murine untransformed hepatocytes. SPARC inhibition, through targeting knock-down with specific siRNA, reveals a role for SPARC in mediating TGF-β-induced EMT in liver tumor cells. Furthermore, SPARC knock-down significantly enhances the TGF-β-induced apoptotic response. Interestingly, SPARC effects might be mediated by Snail, since SPARC silencing impairs Snai1 up-regulation by TGF-β in FaO cells. We next wanted to study the tumorigenesis of FaO cells after in vitro chronic treatment with TGF-β for 4 weeks (TβT-FaO). For this, we injected these cells through both subcutaneous and intrasplenic procedures. Liver tumor formation derived from intrasplenic injection of FaO cells induced a multifocal highly proliferative hepatocarcinoma in all mice, whereas parallel inoculation of TβT-FaO cells promoted low proliferative unifocal and heterogeneous hepatic lesions which showed higher staining for phospho-Smad2. Detailed analysis of tumors revealed lesions with bile duct characteristics and lesions with a dedifferentiated (hepatoblast) phenotype. Primary culture of tumor cells from both FaO- and TβT-FaO-induced intrasplenic lesions indicated that only cells obtained from FaO-induced tumors undergo apoptosis in response to TGF-β, whereas TβT-FaO-derived tumors contain cells that are fully resistant. Analysis of the phenotype of tumors and their derived cells showed that intrasplenic injection of TβT-FaO cells may produce cholangiocarcinoma-like and hepatoblastoma-like tumors. In summary, chronic in vitro TGF- β treatment of FaO cells changed their tumorigenic potential. Tumor growth was slower but cells are resistant to apoptosis. Futhermore, phenotype of lesions reflected a stem-like phenotype which provokes the appearance of less differentiated tumors (hepatoblastomas) or transdifferentiation to a different liver tumor lineage (cholangiocarcinomas).
Modulació de l’activació microglial com a estratègia neuroreparadora
(Universitat de Barcelona, 2011-04-07) Gresa Arribas, Nuria; Solà i Subirana, Carme; Saura Martí, Josep; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[cat] L’activació microglial és un fenomen fisiològic que permet resoldre alteracions a l’homeostasi. Quan l’estímul desencadenant de l’activació microglial és proinflamatori, es desencadena una resposta inflamatòria en la que la micròglia produeix citocines i altres factors proinflamatoris que tenen potencial neurotòxic. Si aquesta activació es dóna de forma exacerbada o es cronifica, pot acabar tenint un efecte perniciós. De fet, diversos autors postulen que l’activació microglial pot agreujar el curs de patologies com l’Alzheimer o el Parkinson. És per això que en aquesta tesi ens vam plantejar la inhibició del fenotip proinflamatori de l’activació microglial com una diana terapèutica en les malalties neurodegeneratives. El primer objectiu va ser establir i caracteritzar un model in vitro de neuroinflamació, en el que estudiar el patró d’activació microglial a cultius tractats amb un estímul proinflamatori (LPS + interferó gamma). Així, vam determinar que la micròglia estimulada amb LPS/IFN-gamma s’activa amb un patró de resposta proinflamatori que es caracteritza per un increment en l’expressió dels enzims iNOS i COX-2 i en la producció de NO, TNF-alfa i IL-6. En una segona fase es va establir i caracteritzar un model de cocultiu de neurones i micròglia on estudiar la neurotoxicitat induïda per activació microglial en el que vam determinar que l’activació de la micròglia en resposta al LPS/IFN-gamma té un efecte neurotòxic principalment mediat per la producció de NO, mentre que el TNF-alfa la IL-6 i la COX-2 tenen un paper secundari. Una vegada establert el model experimental vam abordar la modulació de l’activació microglial inhibint els factors implicats en l’activació proinflamatòria, en concret els C/EBPs, ja que aquests factors regulen l’expressió de molts dels gens implicats en la resposta proinflamatòria microglial. La nostra hipòtesi era que la inhibició dels C/EBPs disminuiria aquesta resposta i tindria un efecte neuroprotector. La inhibició es va abordar des d’una aproximació farmacològica i una aproximació genètica. La inhibició farmacològica es va fer usant el flavonoide crisina que té efectes antiinflamatoris mediats per la inhibició dels C/EBPs en macròfags. Així, vam determinar que la crisina té un efecte antiinflamatori i neuroprotector i que aquest està mediat, si més no en part, per la inhibició de C/EBP-delta. Posteriorment, mitjançant la utilització de micròglia de ratolins deficients en C/EBP-beta o C/EBP-delta, vam determinar que l’absència de C/EBP-beta o C/EBP-delta inhibeix l’activació microglial i la neurotoxicitat associada. Els C/EBPs per tant són una possible diana terapèutica addicional per al tractament de patologies que cursen amb neuroinflamació. Per últim es va plantejar la inhibició de la sobreactivació microglial proinflamatòria potenciant els senyals inhibidors que mantenen a la micròglia en un estat quiescent, en concret la parella lligand-receptor CD200-CD200R. La nostra hipòtesi era que modulant l’activació de CD200R es podria inhibir la sobreactivació microglial i la neurotoxicitat associada. Així el tercer objectiu va ser estudiar, d’una banda quins estímuls poden modular l’expressió de CD200 a les neurones, i de l’altra quin és el paper de CD200 i CD200R en la modulació de l’activació microglial per part de les neurones. Per abordar aquest objectiu es va establir un model de mort neuronal apoptòtica i un model de mort neuronal necròtica per excitotoxicitat. En aquest model vam determinar que l’expressió de CD200 augmenta en neurones que estan morint, ja sigui per apoptosi com per necrosi, el que podria constituir un mecanisme de control de l’activació microglial en presència de mort neuronal (no es pot descartar que l’efecte observat sigui degut a una major estabilitat CD200 en front a altres proteïnes neuronals). Per últim ens vam plantejar estudiar l’efecte de la modulació de la senyalització CD200-CD200R sobre l’activació microglial i la neurotoxicitat associada, demostrant quel’expressió proteica de CD200 a neurones no es modula per estímuls antiinflamatoris com la IL-4 i la IL-10 ni proinflamatoris com el LPS i l’IFN-gamma. En resum, els resultats d’aquesta tesi mostren la utilitat dels models experimentals in vitro per estudiar la resposta inflamatòria de la micròglia i la neurotoxicitat resultant. Amb aquests models hem pogut establir la importància de la família de factors de transcripció C/EBPs en la regulació de la resposta inflamatòria microglial i suggerir la rellevància de CD200 en la comunicació entre la micròglia i les neurones que han entrat en un procés de mort cel•lular.
Desenvolupament d’una teràpia anti-amiloide per a la malaltia d’Alzheimer en el gos amb disfunció cognitiva
(Universitat de Barcelona, 2012-06-12) Bosch Pont, Mª Neus; Mahy Gehenne, Josette Nicole; Rodríguez Allué, Manuel José; Universitat de Barcelona. Departament de Ciències Fisiològiques I
[cat] Introducció: La Malaltia d’Alzheimer (AD), és la malaltia neurodegenerativa amb més incidència actualment. La hipòtesi més acceptada sobre l’origen de la malaltia és la “hipòtesi amiloide”, en la que el cúmul de pèptid beta amiloide (Aβ) a l’espai extracel•lular a cervell du a la formació d’oligòmers solubles, fibril•les i plaques provocant una disfunció sinàptica i neuronal i, conseqüentment, dèficits cognitius. Tots aquests esdeveniments van acompanyats de neuroinflamació i de la formació de cabdells neurofibril•lars. Diversos són els models animals utilitzats per a l’estudi l’AD, dintre dels quals hi trobem els gossos de companyia envellits s’ha descrit la Síndrome de Disfunció Cognitiva (CDS). Els gossos amb la CDS es caracteritzen per presentar per alteracions a nivell cognitiu, anatòmic i histopatològic similars les descrites anteriorment i comparables a les observades en els estadis inicials de l’AD. Totes aquestes convergències, fan que el gos amb la CDS sigui considerat un bon model natural d’envelliment humà i dels estadis més inicials de l’AD i que pugui ser de gran utilitat en estudis de tractaments dirigits l’AD. Dintre dels tractaments dirigits a la prevenció de la formació i/o eliminació d’amiloide hi trobem les immunoteràpies anti-amiloide actives. Aquestes, mitjançant l’administració d’un fragment d’Aβ sintètic combinat amb diversos adjuvants i proteïnes transportadores, indueix l’eliminació d’amiloide de Sistema Nerviós Central cap a la perifèria mitjançant diversos mecanismes. Des de l’estudi fet l’any 2000 amb la immunoteràpia (AN1792), dissenyada a partir de l’Aβ42 i QS21 com a adjuvant, que va provocar un 6% de casos de meningoencefalitis en els pacients inclosos a l’estudi, diversos han estat els esforços per dissenyar vacunes eficaces i que evitin els efectes secundaris no desitjats. Objectiu general: En aquest treball es planteja si l’administració d’una immunoteràpia dissenyada a partir d’un adjuvant que indueix respostes de tipus Th2 o anti-inflamatòria juntament amb un fragment C-terminal del pèptid Aβ fibril•lar indueix una millora cognitiva en gossos amb CDS, evitant els efectes nocius observats en immunoteràpies ja testades en humans.

Examinar

Enviaments recents