Efecte de la glucosa en un model d'isquèmia "in vitro": modulació del factor induït per hipòxia i de la mort cel·lular programada.

Abstract

[cat] La present tesi estudia el paper de la glucosa en la mort cel·lular i la resposta a hipòxia en un model d'isquèmia in vitro amb cèl·lules de la línia cel·lular derivada de neuroblastoma humà SH-SY5Y diferenciades amb àcid retinoic, que es sotmeten a un període d'anòxia en presència o absència de glucosa i un de posterior reoxigenació també en presència o absència de glucosa, afegint la glucosa en la reoxigenació. La privació exclusiva d'oxigen (OD, de l'anglès oxygen-deprivation) indueix una baixa mortalitat, que no s'altera després de la reoxigenació; no obstant la privació d'oxigen i glucosa (OGD, de l'anglès oxygen and glucose deprivation) indueix major mortalitat, que s'incrementa durant la reoxigenació posterior, essent significativament més elevada quan s'afegeix glucosa en la reoxigenació. L'OGD indueix l'alliberament de factors pro-apoptòtics mitocondrials com AIF (de l'anglès apoptosis inducing factor) i citocrom c, no obstant només quan la reoxigenació és en presència de glucosa en la reoxigenació s'observa l'activació de caspases. La seva inhibició indueix la reducció de la mortalitat associada a l'apoptosi. També en cultius primaris neuronals sotmesos a 1h d'OGD s'observa l'activació de caspasa 3. Els nivells energètics cel·lulars disminueixen dràsticament en acabar la OGD, no obstant es recuperen progressivament en la reoxigenació posterior, essent significativa la diferència causada per la presència de la glucosa en la reoxigenació. Pensem que aquest fet pot ser el condicionant per a l'activació diferencial de les caspases tot i l'alliberament comú de factors pro-apoptòtics en acabar l'OGD. En aquest model l'anòxia estabilitza l'expressió de la subunitat induïble (subunitat α) del factor de transcripció HIF1 (de l'anglès Hypoxia inducible factor 1). La presència de glucosa durant l'anòxia indueix una major expressió de HIF1α i per tant una major activitat de HIF1, reflectida en una major expressió de gens diana com enzims del metabolisme de la glucosa i VEGF (Vascular Endotelial Growth Factor). En la reoxigenació posterior a l'OD HIF1α és ràpidament degradat pel sistema de degradació dependent d'oxigen que implica els enzims Prolilhidroxilases (PHDs) i el sistema ubiquitina-proteasoma (que inclou la proteïna Von Hippel Lindau (pVHL)). Sorprenentment, l'expressió de HIF1α es manté en presència d'oxigen hores després de la reoxigenació posterior a l'OGD. Aquest és un fenomen que depèn de la severitat i la durada de l'anòxia i no sembla estar relacionat amb alteracions del proteasoma o de pVHL, sinó amb una menor hidroxilació de HIF1α per PHDs. La OGD indueix un desequilibri en les concentracions de metabòlits del cicle de Krebs com alfacetoglutarat i fumarat. Ja que el primer es coneix com a cosubstrat de les PHDs i alguns estudis apunten que el segon pot funcionar com a inhibidor de la reacció i donat que hem observat que l'addició de fumarat indueix l'expressió de HIF1α en normòxia en les cèl·lules SH-SY5Y diferenciades, pensem que l'abundància relativa dels metabòlits en acabar la OGD és menys favorable per a la hidroxilació de HIF1α i aquest es manté en la reoxigenació tot i la presència d'oxigen.

[eng] This thesis is focused on the effects of glucose on cell death and on the cellular response to hypoxia in an in vitro model of ischemia using a neuroblastoma-derived cell line (SH-SY5Y) differentiated with retinoic acid. The model is based on an initial period of anoxia in either the presence or absence of glucose followed by a period of reoxygenation also in the presence or absence of glucose (added at the reoxygenation phase). The anoxic period in the presence of glucose (OD, oxygen-deprivation) induces a very low percentage of cell death, which does not increase after reoxygenation. However, anoxia in the absence of glucose (OGD,oxygen-glucose deprivation) causes a higher percentage of cell death, which increases after reoxygenation specially when glucose is added. OGD induces the release of apoptotic factors from mitochondria such as Apoptosis inducing factor (AIF) and cytochrome c. However, we only observe caspase 3 activation in the presence of glucose after reoxygenation and its inhibition decreases apoptotic cell death. Intracellular ATP levels decrease after OGD but recover after reoxygenation being significantly higher in the presence of glucose at reoxygenation, which we think is related with the differential activation of caspases. We also observe caspase 3 activation after OGD followed by reoxygenation in neuron primary cultures. The HIF1 inducible subunit (HIF1α) stabilizes after anoxia in this model of ischemia, especially in the presence of glucose, where its transcriptional activity correlates with HIF1α expression. After reoxygenation after OD, HIF1α is degraded by the known degradation system which involves prolylhydroxylases (PHDs) and the Ubiquitin-proteasome system (including the Von Hippel Lindau protein, VHLp). Surprisingly, HIF1α is maintained for hours after reoxygenation after OGD, which seems unrelated to alterations of the proteasome or pVHL, but to a lower hydroxylation by PHDs. This is probably related to alterations in the concentrations of metabolites of the Krebs cycle, such as alphaketoglutarate and fumarate, wich are a known cosubstrate of the PHDs reaction and a recently described inhibitor, respectively.