Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)
URI permanent per a aquesta col·leccióhttps://hdl.handle.net/2445/36237
Examinar
Enviaments recents
Mostrant 1 - 20 de 35
TesiAnàlisi genètica i molecular de la síndrome de Down. Aïllament de gens a la regió cromosòmica 21q22.2-q22.3: identificació i caracterització del gen Minibrain (MNBH)(Universitat de Barcelona, 1988-11-03) Guimerà i Vilaró, Jordi; Pritchard, Melanie; Estivill, Xavier, 1955-; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[cat] Aquest treball està emmarcat dins la línia d'investigació sobre el cromosoma 21 humà i la síndrome de Down que el Centre de Genètica Mèdica i Molecular duu a terme i de la qual aquesta tesi en forma part. La síndrome de Down s'ha d'estudiar com una patologia genètica complexa, potser la més complexa de les que es coneixen en humans. Aquesta tesi està estructurada en set parts ben diferenciades. En la primera tracto els aspectes característics i generals de la síndrome de Down. En la segona presento els objectius que van motivar el treball d'aquesta tesi. En la tercera part descric detalladament els materials i mètodes emprats, a fi i efecte de permetre la realització de cadascuna de les tècniques presentades i la reproducció dels resultats mostrats. En la quarta recopilo els resultats dels treballs presentats en forma de publicacions. En la cinquena part presento un resum dels resultats i la seva discussió i es dóna pas a l’apartat de les conclusions del treball científic. La setena i darrera part de la memòria presentada conté la informació bibliogràfica referenciada. He intentat, de manera més o menys encertada, trobar aquella traducció al català més correcta de cadascun dels mots tècnics propis del llenguatge científic, ja que en el procés d'incorporació de terminologia al català s'han produït força vacil·lacions. Tanmateix, s'ha conservat la denominació original en cursiva. L'única finalitat d'aquest manlleu lèxic (bàsicament llatinismes i anglicismes) ha estat la de facilitar la comprensió del text. Tenint com a horitzó aquest mateix objectiu i per tal d'establir una regularitat i una coherència entre la presentació de les sigles acronímiques que apareixen en els articles publicats en anglès i aquelles que apareixen en els diferents apartats de la tesi, he preferit conservar l'ordre de les inicials de les sigles emmanllevades. D'aquesta manera, referint-se a la síndrome de Down trobarem DS i no SD. Finalment, he volgut no duplicar la descripció dels resultats en els diferents apartats d'aquesta memòria, de manera que en l'apartat de resum i discussió he posat l'accent en aquells resultats que no s'han escaigut en l'apartat de resultats dels articles publicats, però que per la seva importància, per facilitar i ampliar la comprensió dels resultats presentats, he cregut adequat presentar-los.- TesiRegulació del transportador de glucosa GLUT1 en cèl·lules endotelials i musculars(Universitat de Barcelona, 1996) Viñals Canals, Francesc; Zorzano Olarte, Antonio; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[spa] En respuesta a elevadas concentraciones de glucosa en el medio, las células endoteliales ECV304 no sufren modificaciones en el transporte de glucosa, pero sí en la actividad de la enzima hexoquinasa. La enzima PI3K está implicada tanto en la estimulación por la insulina del transporte de glucosa, como en el trafico intracelular de GLUT1 en mioblastos SOL8. Tanto las células musculares SOL8 como las L6E9 presentan una transición en la expresión de transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT4 durante la diferenciación de mioblastos a miotubos. La diferenciación reprime la actividad transcripcional de un fragmento de 2240 PB del promotor de GLUT1. Este efecto se debe a modificaciones en los 33 PB situados a 5' del origen de transcripción y en el fragmento situado entre -99 y -33. La diferenciación de las células L6E9 y la sobrexpresión de MYOD conducen a la represión de la expresión del factor de transcripción SP1 y a la eliminación de la formación de complejos en un elemento SP1 Localizado en el fragmento -99/-66 del promotor de GLUT1.
- TesiInteracción funcional entre la adenosina desaminasa y el receptor A1 de adenosina en la superficie celular(Universitat de Barcelona, 1998-01-14) Saura Antolín, Carlos A. (Carlos Alberto); Canela Campos, Enric I. (Enric Isidre), 1949-; Franco Fernández, Rafael; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[spa] La adenosina deaminasa (ADA) es una enzima del metabolismo purínico que ha sido hallada tanto en el citosol como en la superficie celular. En este estudio se ha demostrado que la ADA interacciona con los receptores A1 de adenosina (A1Rs) en corteza cerebral de cerdo y en la línea celular DDT1MF-2. A través de esta interacción la ADA aumenta la afinidad del receptor A1 por los ligandos agonistas, permite la aparición del estado de alta afinidad del receptor (receptor-proteína G) y es necesaria para la correcta transducción de la señal del receptor A1. Los mecanismos moleculares involucrados en la desensibilización homóloga de los A1Rs se estudiaron en células DDT1MF-2. La exposición crónica de las células con el agonista R- PIA produce una rápida desensibilización funcional, la fosforilación y la agregación en la superficie celular de los receptores A1. La internalización de los A1Rs hacia compartimentos intracelulares es un proceso lento (horas) y conduce a la “down-regulation” de éstos. El antagonista, por el contrario, induce la aparición de nuevos centros de unión en la membrana. Todos los procesos implicados en la desensibilización homóloga del receptor A1 son acelerados y aumentados por la ADA. El agonista induce también la internalización conjunta de la ADA y los A1Rs. Estos resultados muestran una regulación mutua y una vía de endocitosis común de la ADA y el A1R de adenosina durante el proceso de desensibilización. Este es el primer estudio donde se demuestra que un miembro de la familia de receptores acoplados a proteína G requiere una ectoenzima, cuyo sustrato es el ligando del receptor, para una eficiente señalización y regulación funcional.
- TesiPegilació i vehiculització mitjançant anticossos, de liposomes i d'adenovirus: aplicació a la transferència gènica i al transport de citostàtics(Universitat de Barcelona, 2002-07-23) Carrión Ribas, Carme; Domingo i Pedrol, Joan Carles; Madariaga de las Heras, M. África de; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[spa] El Polietilenglicol (PEG) es una molécula de gran interés, ya que es capaz de prolongar el tiempo de residencia en sangre de muchas moléculas, como las proteínas, los oligonucleótidos, los liposomas o los adenovirus. En el transcurso del trabajo de esta tesis doctoral se ha estudiado la aplicación del PEG en tres ámbitos distintos: la incorporación del PEG a liposomas mediante su unión al colesterol (Chol), la incorporación del PEG a inmunoliposomas que encapsulan Doxorubicina (Dox) y finalmente, la unión del PEG a adenovirus, a los que, a la vez, se ha incorporado anticuerpos monoclonales (AcMo). - APLICACIÓN DE DERIVADOS PEGILADOS DE COLESTEROL EN SISTEMAS LIPOSOMALES Se ha optimizado la síntesis de dos derivados pegilados del colesterol, en concreto el Chol-PEG, derivado en el que el Chol se une directamente al PEG mediante un enlace carbamato, y el Chol-L-PEG, molécula en la que el Chol no se une directamente al PEG sino mediante una barra espaciadora de 6 átomos. El Chol-PEG es menos eficiente que el Chol-L-PEG y genera defectos en las membranas a las que se incorpora. Ambos derivados son capaces de mantener la capacidad antigénica de los AcMo que se unen al extremo del PEG y permiten direccionar los liposomas hacia tejidos concretos. - TOXICIDAD IN VITRO DE INMUNOLIPOSOMALES (SIL) ANTI-CD34 Y ANTI-EGFr QUE ENCAPSULAN DOX La encapsulación de la Dox en SIL permite dirigir los efectos de este fármaco de forma específica. Los AcMo utilizados han sido el My10, que reconoce el antígeno CD34, y el 425, que se une al EGFr. El CD34 nos ha permitido comprobar la eficiencia de los SIL en un modelo de tumores circulantes, en el que la interacción del Ac con el antígeno no va seguida de la endocitosis del complejo. En este caso los SIL tienen el mismo efecto citotóxico que la Dox libre, pero permiten dirigirla específicamente. Por su parte, el EGFr, nos ha servido como diana representativa de los tumores sólidos.
- TesiBiosíntesis de mediadores lipídicos derivados de la 5-lipooxigenasa en el sinusoide hepático. Implicaciones en la fibrogénesis hepática.(Universitat de Barcelona, 2004-07-21) Titos Rodríguez, Esther; Clària i Enrich, Joan; López-Soriano, Francisco J.; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[spa] La fibrosis hepática es el resultado de un proceso inflamatorio y de reparación de tejido en respuesta a un daño hepático prolongado y se define como la acumulación de tejido conectivo en el hígado debido a un importante desequilibrio entre la producción y la degradación de matriz extracelular. Mientras que la fibrosis hepática es un proceso reversible, su estadío final, la cirrosis, está considerado como el estadío irreversible y final de la enfermedad. Cuando la cirrosis es ya severa se produce la completa desestructuración del parénquima hepático dando lugar a la aparición de insuficiencia hepática y trastornos hemodinámicos graves. Una de las primeras complicaciones hemodinámicas es la aparición de hipertensión portal que tiene lugar como consecuencia de un incremento de la resistencia intrahepática al paso de flujo sanguíneo portal así como de un aumento intrínseco del tono vascular de la microvasculatura hepática. Existe un enorme interés científico no sólo por esclarecer los mecanismos celulares implicados en el desarrollo de fibrosis y cirrosis hepática sino también por identificar nuevas estrategias terapéuticas enfocadas a revertir o prevenir la progresión de esta enfermedad hepática. Una de las posibles dianas terapéuticas la constituye la vía biosintética de la 5-LO. La 5-LO es la enzima clave responsable de la síntesis de LTs, importantes mediadores lipídicos derivados del AA. Este grupo de eicosanoides incluye al LTB4 implicado principalmente en la respuesta inflamatoria y los cisteinil-LTs (LTC4/LTD4/LTE4) que son potentes agentes vasoconstrictores capaces de incrementar la permeabilidad vascular y ejercer importantes funciones proliferativas y profibrogénicas. En el hígado y a nivel experimental, los cisteinil-LTs son capaces de modificar tanto la presión hepática de perfusión como la extravasación de fluido vascular. Además, los estudios clínicos demuestran que en los pacientes con hepatopatía existe un incremento en la producción de estos eicosanoides lo que se ha asociado con el desarrollo de un incremento en la resistencia intrahepática y la aparición de colestasis. Sin embargo y hasta la realización de este proyecto de tesis doctoral, no se conocían con exactitud los mecanismos celulares de síntesis de estos eicosanoides en el hígado así como la implicación fisiopatológica de estos compuestos en el desarrollo de la cirrosis hepática y sus complicaciones. Por todo ello, los objetivos generales de este trabajo fueron: 1. Caracterizar la biosíntesis y papel funcional de los cisteinil-LTs en el sinusoide hepático. 2. Investigar el papel de la célula de Kupffer y de la 5-LO en la patogénesis de la fibrosis hepática experimental. En resumen, los resultados de este trabajo indicaron que en el hígado, no sólo la célula de Kupffer contribuye a la producción endógena de cisteinil-LTs sino que los hepatocitos contribuyen de forma importante a su producción mediante metabolismo transcelular. Además, estos eicosanoides pueden ejercer acciones paracrinas sobre las células hepáticas estrelladas y contribuir así al aumento de la resistencias intrahepáticas y a la aparición de hipertensión portal. Además, los resultados proporcionan la primera evidencia de que la presencia activa de la vía metabólica de la 5-LO es crítica para la supervivencia de las células de Kupffer y demuestran que la inhibición de la vía de la 5-LO en las células de Kupffer puede reducir la progresión de la fibrosis durante el daño hepático crónico experimental.
- TesiInvestigación y desarrollo de abaperidona, nuevo antipsicótico 5HT2A/D2 y alfa1-adrenérgico. Modelos "in vitro" e "in vivo" predictivos de eficacia y efectos adversos(Universitat de Barcelona, 2004-03-26) Príncep i Mota, Marta; Guglietta, Antonio; Pastor Anglada, Marçal; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[spa] La esquizofrenia es una enfermedad altamente prevalente, cerca del 1% de la población, en la que se distinguen tres grandes tipos de sintomatología, los déficits cognitivos, los síntomas positivos y los síntomas negativos, con distinta respuesta a los tratamientos actuales. Abaperidona, es una nueva entidad química investigada y desarrollada como potencial antipsicótico atípico, con un favorable perfil 5HT2/D2 y elevada afinidad por el receptor alfa1-adrenérgico. Abaperidona también mostró afinidad en rango nM por otros receptores centrales (D3, D1, 5HT2C, 5HT1A y H1) y escasa afinidad (superior a 100 nM) por los receptores muscarínicos. Este compuesto se evaluó mediante pruebas predictivas tanto de eficacia antipsicótica como de efectos extrapiramidales (EPS). Abaperidona inhibió de manera dosis dependiente las hiperactividades inducidas por agonistas dopaminérgicos en ratón y revirtió los déficits sensorimotores (PPI) inducidos por apomorfina en ratas. Además, Abaperidona demostró elevada afinidad por el receptor 5HT2A en el córtex y bloqueó potentemente las sacudidas de cabeza inducidas por DOI [1-(2,5-dimetoxi-4-iodofenil)-2-aminopropano, agonista preferente 5HT2A] en ratón, así como tendencia a revertir de manera dosis dependiente la hipolocomoción inducida por mCPP (1-(3-clorofenil)piperazina, agonista 5HT2C). Su potente antagonismo alfa1-adrenérgico se demostró en estudios funcionales en rata anestesiada y desmedulada y en la protección a la letalidad inducida por noradrenalina, a dosis 5 veces inferiores a las necesarias para inducir el bloqueo de los receptores D2. Sin embargo, Abaperidona únicamente indujo EPS a dosis entre 21 (estereotipias inducidas por agonistas dopaminérgicos) y 35 (catalepsia) veces superiores a las dosis predictivas de actividad antipsicótica preclínica, y demostró menor regulación ascendente del receptor D2 en el estriado que Haloperidol y Risperidona tras administración prolongada. Además, la inducción de prolactina debida a la administración del compuesto fue significativamente menor que la inducida por Haloperidol o Risperidona. Abaperidona también demostró una potente acción moduladora del receptor NMDA al inhibir la hiperactividad inducida por dizocilpina (antagonista NMDA) en el mismo rango de dosis que la dosis predictiva de actividad antipsicótica preclínica. Interesantemente, Abaperidona no mostró efectos significativos sobre la presión arterial y escasos efectos sobre frecuencia cardiaca en estudios en ratas conscientes, inclusive a dosis 10 veces superiores a la dosis predictiva de actividad antipsicótica preclínica, a diferencia de Risperidona y Clozapina. Abaperidona también demostró escasa inducción de sedación comparativamente a Haloperidol, Risperidona y Clozapina. En resumen, el antagonismo a los receptores 5HT2A y alfa1-adrenérgico, favorecería las acciones en las vías mesolímbicas y mesocorticales dopaminérgicas frente a las vías dopaminérgicas menores, por lo que podría contribuir a la mejora de la eficacia, incluyendo los síntomas cognitivos y negativos, y minimizando la aparición de EPS, mientras que el antagonismo a 5HT2C, por su acción sobre la vía dopaminérgica tuberoinfundibular, contribuiría a controlar la prolactinemia. Además la modulación de los niveles de glutamato, también contribuiría a la mejora cognitiva y de la sintomatología negativa. En conclusión, Abaperidona mostraría un perfil farmacológico multireceptorial indicativo de actividad terapéutica sobre la sintomatología global de la esquizofrenia, con escasa propensión a la aparición de efectos adversos relacionados con el mecanismo de acción.
- TesiEstudio de la vía de presentación de péptidos por moléculas de MHC de clase II mediante estrategias proteómicas(Universitat de Barcelona, 2005-02-25) Carrascal Pérez, Montserrat; Abián, Joaquín; Jaraquemada, Dolores; Llobera i Sande, Miquel; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[spa] En situaciones patológicas, como en el caso de la autoinmunidad, las células epiteliales de tejidos expresan ectopicamente moléculas de MHC de clase II. El estudio de los mecanismos que dan lugar a la formación de los complejos MHC-péptido, su presentación en la superficie de la APC y el reconocimiento de los mismos por parte de las células T es fundamental para poder entender, no sólo la respuesta inmune a infecciones, sino también patologías tan relevantes como el cáncer, la autoinmunidad o el rechazo de y/o mantenimiento de la enfermedad. En esta tesis se ha abordado el estudio de la presentación de péptidos por moléculas de MHC de clase II utilizando diversas estrategias proteómicas. En primer lugar, el trabajo se centró en la caracterización de los repertorios peptídicos asociados a una APC y a células epiteliales que expresaban moléculas de MHC de clase II, secuenciándose más de 300 ligandos peptídicos, incluyendo diversos péptidos presentados ex vivo en tiroides afectados por una patología autoinmune. Mediente este estudio se mostró que existen diferencias en los repertorios asociados a las células epiteliales frente a los presentados por las APC, tanto en las características de los péptidos como en las de las proteínas de las cuales derivan. Asimismo, se muestra como la expresión de las chaperonas HLA-DM y Ii afecta a las características del repertorio. Finalmente, se identificaron péptidos de clase II presentados en tiroides humanos afectados por la enfermedad de Graves-Basedow, entrre ellos un péptido derivado de la tiroglobulina, una proteína descrita como autoantígeno de esta enfermedad. En una segunda parte del trabajo se ha estudiado el efecto de la transfección de las moléculas HLA-DR, HLA-DM y Ii sobre el proteoma de las células epiteliales y se han identificado diversas proteínas implicadas en este proceso, mostrando que a pesar de no existir cambios drásticos en el proteoma global, algunas proteínas implicadas en el metabolismo celular varían su expresión. Asimismo, se han identificado 30 proteínas que se encuentran asociadas directamente o a través de otras moléculas con las moléculas de HLA-DR4 en la célula , entre ellas diversas chaperonas y enzimas de oxidoreducción, y proteínas implicadas en el transporte asociado a membranas. La expresión de estas proteínas dependía además de la expresión de la chaperonas Ii y DM por lo que se sugiere que algunas podrían estar implicadas en la generación, procesamiento o presentación de péptidos por las moléculas de MHC de clase II.
- TesiPaper de l'Amino-Oxidasa Sensible a Semicarbazida, SSAO/VAP-1, del teixit adipós en la diabetis "mellitus"(Universitat de Barcelona, 2003-06-10) Abella Martí, Anna; Martí, Luc; Zorzano Olarte, Antonio; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[cat] L'SSAO/VAP-1 és una proteïna amb una dualitat de funció; d'una banda, presenta activitat enzimàtica amino-oxidasa i, de l'altra, presenta propietats d'adhesió que la impliquen en l'extravasació de limfòcits en processos inflamatoris. Aquesta proteïna es troba altament expressada en el teixit adipós. En els darrers anys, s'ha passat de considerar el teixit adipós com un òrgan d'emmagatzematge energètic a considerar-lo un teixit de vital importància per al control del metabolisme glucídic de l'organisme implicat en la patologia diabètica. El transport de glucosa al teixit adipós i al múscul esquelètic és un pas limitant en l'ús de glucosa i la resistència a la insulina es manifesta en una disminució de la capacitat de la insulina per estimular el transport de glucosa en aquests teixits. Amb la intenció d'avaluar el possible paper fisiològic de l'abundància d'SSAO al teixit adipós, treballs previs d'aquest grup de recerca havien demostrat que substrats de l'SSAO en combinació amb vanadat podien estimular el transport de glucosa per via de l'estimulació de la translocació dels transportadors de glucosa GLUT4 a la membrana de la cèl·lula en adipòcits aïllats de rata. Així, el primer objectiu va ser: 1. Estudiar el mecanisme molecular d'acció de la combinació de benzilamina i vanadat a les cèl·lules adiposes i determinar la molècula activa generada responsable dels efectes observats. Un cop demostrat l'efecte insulinomimètic de la combinació de benzilamina i vanadat sobre cèl·lules adiposes, calia passar a estudis in vivo en models animals; així els següents objectius van ser: 2. Estudiar l'efecte de l'administració aguda o crònica de la combinació de benzilamina i vanadat sobre animals no diabètics i en models de diabetis de tipus 1 i tipus 2. 3. Estudiar l'efecte del tractament crònic amb benzilamina i vanadat sobre el metabolisme del teixit adipós i del múscul esquelètic, així com sobre l'activitat dels illots pancreàtics. Atesa la importància del teixit adipós en la patologia diabètica, l'elevada activitat SSAO present en aquest teixit i el fet que l'activitat SSAO present en el plasma està augmentada en la diabetis mellitus, un altre objectiu va ser: 4. Analitzar la participació del teixit adipós en l'alliberament de la forma soluble de l'SSAO/VAP-1. Els resultats obtinguts en la tesi han estat publicats en tres articles originals més un article de revisió, a més hi ha un article pendent d'acceptació. Les conclusions derivades són les següents. 1. Els substrats de l'SSAO en combinació amb vanadat estimulen el transport de glucosa als adipòcits en condicions en les quals es produeix peroxovanadat, s'inhibeix l'activitat proteïna tirosina-fosfatasa i s'activa l'IRS-1, l'IRS-3, la PI3K i la PKB. 2. L'administració aguda de benzilamina i vanadat augmenta la tolerància a la glucosa de rates no diabètiques i en rates diabètiques de tipus 1 i 2; així mateix, estimula el transport de glucosa al múscul. 3. L'administració crònica de benzilamina i vanadat normalitza la glucèmia en rates diabètiques. 4. En rates diabètiques per estreptozotocina, l'administració crònica de benzilamina i vanadat augmenta el transport de glucosa basal i l'estimulat per insulina i la quantitat total de GLUT4, als adipòcits. En rates Goto-Kakizaki, augmenta el transport de glucosa i la quantitat de GLUT4 present a la membrana plasmàtica als adipòcits no estimulats i el transport estimulat per insulina al múscul. 5. En rates Goto-Kakizaki, la combinació de benzilamina i vanadat estimula la secreció d'insulina en illots pancreàtics. 6. La generació local de peroxovanadat basada en l'activitat SSAO pot representar una nova estratègia terapèutica per al tractament de la diabetis mellitus. 7. Les cèl·lules adiposes alliberen SSAO soluble al medi de cultiu, en un procés dependent de metal·loproteases de matriu i regulat per factors implicats en la resistència a la insulina.
- TesiAnàlisi de l'expressió de NOR-1 en les cèl·lules musculars llises i de la seva implicació en la proliferació cel·lular(Universitat de Barcelona, 2004-03-25) Rius Capalvo, Jordi; Badimón, Lina, 1953-; Martínez González, José; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[cat] Dado que las células musculares lisas vasculares (CMLV) juegan un papel clave en el desarrollo de la aterosclerosis, conocer los genes que regulan la proliferación y migración de estas células pude conducir a encontrar nuevas dianas farmacológicas para tratar esta patología. Nosotros descubrimos que el receptor nuclear huérfano NOR-1/NR4A3 se encuentra expresado en CMLV estimuladas con suero y distintos mitógenos. Entre los componentes del suero cabe destacar como principal inductor de NOR-1 las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y en menor medida las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Por otra parte, distintos factores de crecimiento en especial la trombina y el PDGF, ambos generados en eventos trombóticos, también inducen la expresión de este origen. Los mecanismos moleculares que regulan este proceso son complejos; participan proteínas G sensibles a la toxina pertusis, incrementos en la concentración citosólica de calcio y activación de distintas proteínas quinasas como la PKC, la PKA y MAPKs como la ERK y la p38 MAPK. Estas quinasas pueden activar directa o indirectamente (dependiendo del tipo y contexto celular), al factor de transcripción CREB. Nosotros observamos por primera vez que las LDL son capaces de inducir la activación de CREB y que este mecanismo es dependiente tanto del calcio como de la PKC. CREB se une al promotor de NOR-1 mediante su interacción con tres cajas CRE; además CREB es esencial en la actividad de este promotor, tal como analizamos mediante la cotransfección de un dominante negativo de CREB así como eliminando las cajas CRE por mutagénesis dirigida. Para evaluar el papel de NOR-1 en la proliferación celular, usamos oligodeoxinucleótidos (ODN) antisentido para inhibir la expresión de este gen. Analizamos de manera independiente dos ODN los cuales disminuyen de forma específica a la expresión de NOR-1. En estas condiciones, estos ODN inhiben la síntesis de DNA inducida tanto por el suero como por las LDL. Además, mediante citometría de flujo in vitro de reparación tisular, el bloqueo de la expresión de NOR-1 produce una inhibición de la capacidad de las células para recuperar el área dañada. De todos estos resultados se pude concluir que NOR-1 regula la proliferación de las CMLV y que por tanto podría ser una nueva diana terapéutica en las patologías en que este involucrada una excesiva proliferación de estas células.
- TesiMolecular and functional interactions between adenosine and dopamine receptors. New therapeutic targets for the treatment of Parkinson's disease.(Universitat de Barcelona, 2004-04-16) Canals Buj, Meritxell; Canela Campos, Enric I. (Enric Isidre), 1949-; Lluís i Biset, Carme; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)Adenosine and dopamine receptors are members of the GPCRs family for which a significant segregation between their A2A and D2 subtypes has been demonstrated in the GABAergic striopallidal neurons of the basal ganglia. In addition, several reports suggest an antagonistic interaction between these subtypes at different levels. For this reason the first study has been focused in the characterization of the molecular and functional interaction between A2AR and D2R. Colocalization of these receptors and clustering upon agonist stimulation has been observed by double immunocytochemistry in neuroblastoma SH-SY5Y cells as well as in primary cultures of striatal neurons. In addition, in the neuroblastoma cell line, it has been demonstrated that the internalization of both receptors takes place following their clusterization. Despite the A2AR-D2R heteromerization has been determined by coimmunoprecipitation, we have also studied if this interaction occurs in living cells by using FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) and BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) approaches. Finally, using both, experimental and theoretical modeling data, it is suggested that the helix 5 and 6 and the 3rd intracellular loop of the D2R and the C-terminal tail of the A2AR are important domains for the formation of the A2AR-D2R heteromers. The homodimerization of the adenosine A2AR has also been studied by FRET and BRET. Furthermore, TR-FRET (Time-Resolved FRET) and biotinylation experiments have suggested that the homodimer, not the monomer, is the functional form of the receptor that reaches the cell surface. The last part of this study has been focused in the identification of the adenosine receptors that mediate the regulation of neuronal differentiation and the molecular mechanisms involved in this effect. Agonist-induced stimulation of A1Rs and A2ARs induces neurite outgrowth processes in the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line and also in striatal neuronal precursor cells in primary cultures. The triggering of the expression of TrkB receptor and the arrest of cells in the G1 phase by the activation of adenosine receptors suggest that adenosine may participate in early steps of neuronal differentiation. Furthermore, the signaling transduction pathway involved in these effects have been shown to require both, the MAPK and the PKC activation but in an independent manner. The results presented in this work, therefore, suggest that adenosine not only acts as a key neuromodulator in information handling but also exerts trophic effects that can enhance neuronal differentiation and neuronal repair.
- TesiIdentificació d'un gen d'obesitat i d'altres gens d'expressió alterada en condicions de resistència a la insulina.(Universitat de Barcelona, 2002-01-23) Bach González, Daniel; Zorzano Olarte, Antonio; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[cat] L'obesitat i la diabetis de tipus 2 són dos de les malalties més prevalents a les societats occidentals. L'obesitat és el principal factor de risc per l'aparició de diabetis de tipus 2. Totes dues sovint s'associen a altres patologies com hipertensió, malaltia cardíaca crónica, dislipidèmia...etc. incrementant el risc d'infart i embolia. En conjunt representen un percentatge força elevat de la despesa sanitària en els païssos del nostre entorn. És un tret comú d'ambdues l'aparició de resistència a insulina en múscul, éssent aquesta una de les primeres manifestacions de la diabetis de tipus 2. Tot i que es coneixen alguns gens implicats en l'obesitat i la diabetis de tipus 2 encara sabem poc de les causes moleculars d'aquestes malalties. Per això ens vam propossar identificar gens diferencialment expressats en múscul en condicions de resistència a la insulina i descriure la funció d'aquests gens. Això ho vam fer mitjançant les tècniques de "differential display" i d'hibridació sostractiva ("PCR Select cDNA Substraction") sobre múscul de rates obeses Zucker. Vam identificar el gen anomenat Mitofusina-2 i vam comprovar que la seva expressió estava disminuïda en individus obesos. Mitofusina-2 s'expressa específicament en múscul i teixit adipós i s'indueix durant el procés d'adipogènesi i termogènesi. La sobreexpressió de Mitofusina-2 en fibroblastes 10T1/2 provoca un colapse de la xarxa mitocondrial, mentre que la seva repressió per transfecció estable antisentit impedeix la correcta recuperació de la xarxa mitocondrial després d'un xoc osmòtic. En aquestes condicions les cèl.lules mostren una menor oxidació de glucosa, un menor consum d'oxigen total i una disminuïda termogènesi. La Mitofusina-2 incrementa la seva expressió en múscul de rata en resposta al fred. També vam identificar els gens DOR ("Diabetes and Obesity Regulated gene") i P311, l'expressió dels quals es troba reprimida en múscul esquelètic d'individus obesos i diabètics de tipus 2.
- TesiEstudio teórico de nucelobases: Implicaciones estructurales en ácidos nucleicos.(Universitat de Barcelona, 2001-12-14) Cubero Jordà, Elena; Orozco López, Modesto; Luque Garriga, F. Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[spa] Esta tesis recoge el estudio teórico de algunos de los más importantes tipos de interacciones débiles no covalentes en el ADN. Los sistemas de estudio van desde bases nitrogenadas y nucleósidos en fase gas hasta los ácidos nucleicos en solución. Concretamente se trataran las interacciones débiles pi-catión y los contactos entre bases con el objetivo de profundizar en su naturaleza. Dentro de las interacciones entre bases podemos diferenciar entre: (i) las interacciones de puente de hidrógeno impropio, (ii) las interacciones con bases modificadas, como la 8-aminoinosina y el difluorotolueno, y finalmente (iii) las interacciones no canónicas: Hoogsteen y Watson-Crick reverso, que pueden dar lugar a nuevas estructuras secundarias del ADN. Se utilizan todo un conjunto de técnicas teóricas que van desde la mecánica clásica hasta los más elevados niveles de mecánica cuántica, con la finalidad de aportar la máxima información estructural, reactividad y dinámica que complemente así los datos experimentales disponibles sobre las nucleobases y los ácidos nucleicos. En la primera parte de la presente tesis se describirán los métodos teóricos empleados para caracterizar las interacciones no covalentes. En la segunda parte se detallarán brevemente la estructura y las propiedades de los ácidos nucleicos. A continuación, se presentarán los resultados de las interacciones estudiadas. Y finalmente, se procederá a la discusión de los resultados obtenidos y a las conclusiones.
- TesiImplicació dels proteoglicans i del receptor lipoproteic LRP en l'acumulació lipídica en la paret vascular(Universitat de Barcelona, 2004-04-13) Otero Viñas, Marta; Badimón, Lina, 1953-; Llorente Cortés, Vicenta; Ramírez i Sunyer, Josep Ignasi; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[cat] L'objectiu del present treball de tesi fou estudiar la implicació dels principals proteoglicans presents en la paret vascular i del receptor lipoproteic LRP ("Low density lipoprotein receptor-related protein") en la transformació de les cèl·lules musculars llises de l'íntima arterial en cèl·lules escumoses, elements clau en la iniciació i progressió de la lesió ateroscleròtica. A fi de desenvolupar aquest objectiu s'analitzà la capacitat del proteoglicà versicà de modificar les lipoproteïnes de baixa densitat (LDL) infiltrades en la paret vascular i s'analitzà com aquestes partícules de LDL modificades eren internalitzades pel receptor lipoproteic LRP en les cèl·lules musculars llises vasculars. També s'estudià la contribució dels proteoglicans heparan sulfat com a mecanismes independents o de cooperació amb el receptor LRP en la internalització de les LDL modificades en les cèl·lules musculars llises vasculars. D'altra banda, s'estudiaren els nivells d'expressió del receptor LRP durant el desenvolupament de la lesió ateroscleròtica i com l'acumulació lipídica intracel·lular regula l'expressió d'aquest receptor en les cèl·lules musculars llises vasculars humanes.
- TesiDiferenciación adipocitaria y factores reguladores de la biogénesis mitocondrial. Efectos de los fármacos antiretrovirales.(Universitat de Barcelona, 2004-12-20) Rodríguez de la Concepción, María Luisa; Villarroya i Gombau, Francesc; Giralt i Oms, Marta; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[spa] Los resultados presentados en esta Tesis se engloban en tres bloques de estudio: La implicación del adipocito marrón en la lipomatosis inducida por la terapia antiretroviral de elevada actividad (HAART), el estudio de nuevos factores reguladores de la función mitocondrial en el adipocito marrón y el efecto de los fármacos antiretrovirales en adipocitos en cultivo. El análisis de la expresión del gen marcador del adipocito marrón UCP-1 en varios lipomas de pacientes infectados con VIH y en terapia antiretroviral implica al adipocito marrón en la etiopatología de la lipomatosis asociada a la terapia HAART. El estudio de la regulación de la biogénesis mitocondrial a nivel molecular en adipocitos marrones, nos llevó a observar que la diferenciación del adipocito marrón va asociada a la inducción de los factores de transcripción mitocondrial B1 y B2 y el co-activador PGC-1-alfa, en asociación con una incrementada biogénesis mitocondrial. La expresión génica de estos factores es regulada de forma positiva por agonistas de PPAR-gamma e insulina. Por el contrario, la noradrenalina reprime la expresión de los factores de transcripción mitocondrial B1 y B2 por mecanismos dependientes de transcripción e independientes de síntesis proteica. Ello da lugar a una reducción en la expresión de genes codificados por el genoma mitocondrial como la subunidad II de la citocromo c oxidasa. Este efecto es dependiente del grado de diferenciación del adipocito marrón y se ve favorecido por la presencia de activadores de PPAR-gamma o insulina. La expresión del co-activador PGC-1-alfa se induce por noradrenalina, agonistas PPAR-gamma y agonistas RXR en adipocitos marrones diferenciados, pero no en preadipocitos. Dichas inducciones se dan por mecanismos independientes de síntesis proteica. La inducción de PGC-1-alfa por la noradrenalina se ve favorecida por la presencia de activadores PPAR-gamma. La inducción por agonistas PPAR-gamma y RXR se bloquea por un antagonista PPAR-gamma y es independiente de la activación de receptores adrenérgicos. Se describe, por tanto, una nueva vía de regulación PPAR-gamma/RXR-dependiente del gen PGC-1-alfa. Se estudió el efecto del litio, un fármaco utilizado en el tratamiento de la esquizofrenia y el trastorno bipolar, sobre la diferenciación del adipocito marrón. Se observó que el litio inhibe de forma dependiente del tiempo de exposición y de la dosis la diferenciación morfológica de adipocitos marrones en cultivo, así como la expresión de genes de expresión preferencial en al adipocito marrón. Estudiamos el efecto de los fármacos antiretrovirales inhibidores de la transcriptasa reversa sobre el adipocito marrón mediante el análisis de su diferenciación y expresión génica en relación con la función mitocondrial. Los resultados nos indicaron que los inhibidores de la transcriptasa reversa no-análogos de nucleósido tienen un efecto opuesto sobre la diferenciación del adipocito marrón: el efavirenz bloquea la acumulación de lípidos mientras que la nevirapina tiene un efecto positivo global sobre la diferenciación adipocitaria, biogénesis mitocondrial y expresión de UCP-1. Los inhibidores de la transcriptasa reversa análogos de nucleósidos no afectan la diferenciación del adipocito marrón. La estavudina, zidovudina y didanosina provocan una disminución en el contenido de mtDNA, aunque la expresión del genoma mitocondrial sólo se encuentra disminuida en las células tratadas con didanosina. La compensación a la depleción del mtDNA en las células con estavudina podría explicarse por el aumento en la expresión de los factores de transcripción mitocondrial. Además, la estavudina induce de manera específica la expresión génica de UCP-1 mediante mecanismos que implican la vía del ácido retinoico. Por último, desarrollamos un modelo celular de adipocitos humanos en cultivo primario y lo utilizamos en el análisis del efecto del fármaco antiretroviral didanosina. Los resultados nos mostraron que preadipocitos humanos en cultivo primario pueden diferenciarse a adipocitos con características morfológicas, de expresión génica y funcionales propias del adipocito blanco humano. La didanosina ejerce efectos compatibles con un bloqueo en la función mitocondrial.
- TesiMecanismes de lesió de la cèl·lula Beta en el trasplantament singènic d'illots de Langerhans(Universitat de Barcelona, 2003-01-22) Biarnés Costa, Montse; Montanya Mias, Eduard; Zorzano Olarte, Antonio; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[cat] Una de les alternatives més atractives de futur pel tractament de la Diabetis Mellitus és el trasplantament d'illots pancreàtics. La insuficient quantitat de teixit insular és un dels principals obstacles pel trasplantament d'illots, a més el problema es veu agreujat per el gran nombre d'illots necessaris per realitzar un trasplantament amb èxit. S'ha suggerit que la presència d'una inflamació no-específica en el lloc d'implantació dels illots podria ser una de les causes de la pèrdua primerenca de l'empelt. L'objectiu general fou l'estudi dels fenòmens que tenen lloc en els primers dies després del trasplantament, i específicament els mecanismes de mort dels illots trasplantats, els fenòmens inflamatoris que es produeixen al lloc d'implantació dels illots i la possible contribució de l'estat metabòlic del receptor. Es van trasplantar animals singènics diabètics per injecció amb estreptozotocina amb una massa beta insuficient per restaurar la normoglicèmia. Uns animals es van mantenir hiperglicèmics al llarg de l'estudi i uns altres van ser tractats amb insulina i per tant van normalitzar els nivells de glicèmia. En els primers dies després del trasplantament més de la meitat de la massa beta trasplantada es va perdre malgrat les condicions òptimes del trasplantament degut a un augment de la mort cel·lular beta tant per processos d'apoptosi com de necrosi. A més es va detectar l'expressió del gen de la IL-1beta i iNOS en illots immediatament després de l'aïllament i l'augment de l'expressió d'aquests gens en empelts inicialment després del trasplantament. L'augment en l'expressió dels gens de la IL-1beta i iNOS es produí tant a animals diabètics hiperglicèmics com a animals diabètics normoglicèmics, però els animals hiperglicèmics presentaven una menor expressió dels gens de la IL-1beta i iNOS que els normoglicèmics, suggerint la possible existència d'una limitació en l'augment d'expressió d'aquests gens en els empelts exposats a hiperglicèmia. Per tant en els primers dies després del trasplantament hem demostrat la presència d'una important pèrdua de massa beta que podria contribuir a que sigui necessària una major quantitat d'illots a trasplantar. La detecció de l'expressió dels gens de la IL-1beta i iNOS en els empelts en aquests primers dies després del trasplantament indicaria la presència d'un procés inflamatori en el lloc d'implantació dels illots que podria jugar un paper en l'augment de l'apoptosi i necrosi detectada. Una de les alternatives més atractives de futur pel tractament de la Diabetis Mellitus és el trasplantament d'illots pancreàtics. La insuficient quantitat de teixit insular és un dels principals obstacles pel trasplantament d'illots, a més el problema es veu agreujat per el gran nombre d'illots necessaris per realitzar un trasplantament amb èxit. S'ha suggerit que la presència d'una inflamació no-específica en el lloc d'implantació dels illots podria ser una de les causes de la pèrdua primerenca de l'empelt. L'objectiu general fou l'estudi dels fenòmens que tenen lloc en els primers dies després del trasplantament, i específicament els mecanismes de mort dels illots trasplantats, els fenòmens inflamatoris que es produeixen al lloc d'implantació dels illots i la possible contribució de l'estat metabòlic del receptor. Es van trasplantar animals singènics diabètics per injecció amb estreptozotocina amb una massa beta insuficient per restaurar la normoglicèmia. Uns animals es van mantenir hiperglicèmics al llarg de l'estudi i uns altres van ser tractats amb insulina i per tant van normalitzar els nivells de glicèmia. En els primers dies després del trasplantament més de la meitat de la massa beta trasplantada es va perdre malgrat les condicions òptimes del trasplantament degut a un augment de la mort cel·lular beta tant per processos d'apoptosi com de necrosi. A més es va detectar l'expressió del gen de la IL-1beta i iNOS en illots immediatament després de l'aïllament i l'augment de l'expressió d'aquests gens en empelts inicialment després del trasplantament. L'augment en l'expressió dels gens de la IL-1beta i iNOS es produí tant a animals diabètics hiperglicèmics com a animals diabètics normoglicèmics, però els animals hiperglicèmics presentaven una menor expressió dels gens de la IL-1beta i iNOS que els normoglicèmics, suggerint la possible existència d'una limitació en l'augment d'expressió d'aquests gens en els empelts exposats a hiperglicèmia. Per tant en els primers dies després del trasplantament hem demostrat la presència d'una important pèrdua de massa beta que podria contribuir a que sigui necessària una major quantitat d'illots a trasplantar. La detecció de l'expressió dels gens de la IL-1beta i iNOS en els empelts en aquests primers dies després del trasplantament indicaria la presència d'un procés inflamatori en el lloc d'implantació dels illots que podria jugar un paper en l'augment de l'apoptosi i necrosi detectada.
- TesiClonaje y caracterización de una nueva forma soluble de TNFR2 producida por splicing alternativo. Estudio de su implicación en patologías asociadas a inflamación.(Universitat de Barcelona, 2005-01-26) Láinez Mas, Begoña; Fernández-Real Lemos, José Manuel; López-Soriano, Francisco J.; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[cat] El factor de la necrosis tumoral, TNF-alfa, es una citocina pleiotrópica implicada en un amplio espectro de respuestas inflamatorias y del sistema inmune. El efecto biológico del TNF-alfaestá mediado por dos receptores de membrana, el receptor 1 de TNF, TNFR1 y el receptor 2 de TNF, TNFR2. Estos dos receptores se pueden presentar como receptores solubles formados a partir del procesamiento proteolítico de la región extracelular del receptor de membrana. Se han descrito concentraciones elevadas de receptor soluble de TNFR2 en el suero de múltiples patologías inflamatorias. En este trabajo, describimos por primera vez una isoforma de RNAm de TNFR2 humano, producida por splicing alternativo, a la que le faltan los exones 7 y 8 que codifican la mayor parte de la región citoplasmática y parte del domininio intracitoplasmático de la proteina. El splicing alternativo de los dos exones produjo un cambio en la pauta de lectura, lo que llevó a la aparición de un nuevo codón de parada tras 6 nuevos aminoácidos. Se obtenía de este modo, un cDNA que codificaba una proteína de TNFR2 formada por la misma región extracelular y los mismos 5 primeros aminoácidos del dominio transmembrana, que el TNFR2 nativo, seguidos de 6 nuevos aminoácidos como único extremo carboxilo terminal. El estudio de la expresión de la proteína en células tranfectadas con el cDNA de esta isoforma, mostró la naturaleza soluble de esta proteína. La proteína poseía un peso molecular de aproximadamente 42 KDa. En un ensayo de citotoxicidad inducida por TNF-alfa, se mostró que esta isoforma podía bloquear la apoptosis inducida por TNF-alfa lo que sugiere su función reguladora de la acción del TNF como antagonista de su función biológica. Se desarrolló un ELISA que cuantifica el receptor soluble generado por splicing alternativo. Y se determinaron las concentraciones de receptor soluble producido por splicing alternativo en el suero de individuos sanos y en pacientes de diferentes patologías inflamatorias. Nuestros datos muestran que el receptor soluble producido por splicing alternativo está presente en el suero de individuos sanos a bajas concentraciones y a concentraciones elevadas en sujetos con sepsis y artritis reumatoide. Se determinó que existe una asociación negativa entre el receptor soluble producido por splicing alternativo y varios componentes del síndrome metabólico y también con la resistencia a la insulina. Por otro lado, se observó que los pacientes de artritis reumatoide con valores muy elevados de isoforma, presentaban, probablemente una mejor respuesta a la terapia con anticuerpos anti-TNF-alfa.
- TesiCaracterització de la funció del gen DCC (Deleted in Colorectal Cancer) en cèl·lules epitelials, en relació amb els processos de diferenciació i adhesió cel·lular.(Universitat de Barcelona, 2001-07-05) Martín Peña, Mercè; Fabre, Myriam; Real, Francisco X.; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[cat] La formació de tumors és el resultat d'alteracions genètiques successives que afecten, entre d'altres, a gens implicats en el control de la proliferació cel.lular. En aquest contexte, els proto-oncogens i els gens supressors de tumor han estat definits com a molècules que estan implicades en el control i la diferenciació cel.lular. L'alteració de l'expressió d'aquests gens permet a les cèl.lules escapar als mecanismes de regulació donant lloc a un creixement anormal (revisat a Solommon et al., 1991; Weinberg, 1993). Les pèrdues al.lèliques observades en tumors humans han suggerit la presència de gens supressors de tumor en les regions cromosòmiques. Els experiments efectuats fins ara han permès l'identificació de tres gens candidats: el Smad2, el Smad4 i el DCC. Els objectius concrets de la present tesi doctoral són: a) Estudi de la implicació dels gens DCC i Smad4 en els càncers de còlon i de pàncrees. b) Caracterització de la funció del DCC en les cèl.lules de l'epiteli gastrointestinal. c) Caracterització d'altres molècules implicades en la vida de transducció de senyal del DCC.
- TesiAnàlisi funcional de la regió N-terminal de l'HMG-CoA reductasa d'Arabidopsis(Universitat de Barcelona, 2003-09-26) Leivar Rico, Pablo; Campos Martínez, Narciso; Boronat i Margosa, Albert; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[cat] Les plantes sintetitzen una gran varietat de compostos isoprenoides a través d'una ruta metabòlica complexa i ramificada. L'enzim HMG-CoA reductasa (HMGR) catalitza la conversió d'HMG-CoA en mevalonat, una etapa limitant de flux per la biosíntesis d'isoprenoides en el citosol-reticle endoplasmàtic (RE). En totes les espècies de plantes analitzades existeixen vàries isoformes d'HMGR codificades per petites famílies multigèniques. En el cas d'Arabidopsis, existeixen dos gens ( HMG1 i HMG2 ) que codifiquen per tres isoformes de l'enzim: HMGR1L, HMGR1S i HMGR2. Múltiples estudis suggereixen que les isoformes d'HMGR de plantes estarien implicades en la síntesi d'isoprenoides particulars. Aquest model d'especialització funcional de les isoformes d'HMGR està basat en estudis d'expressió gènica en diferents estadis del desenvolupament o en resposta a diferents estímuls. Tot i així, a l'inici d'aquesta tesi, no es tenien dades contrastades de la distribució de les isoformes d'HMGR en diferents teixits ni de la seva distribució subcel·lular. Aquest darrer aspecte era particularment interessant, doncs s'havia suggerit que l'especialització funcional de les isoformes d'HMGR podria venir determinada, en part, per diferències en la seva localització subcel·lular. Amb aquests antecedents, es va iniciar un estudi de la distribució tissular i subcel·lular de les diferents isoformes d'HMGR d'Arabidopsis. Mitjançant assaigs de western blot utilitzant anticossos generats contra el domini catalític de l'enzim, es va comprovar que les isoformes HMGR1S i HMGR1L es distribuïen de manera diferencial en teixits d'Arabidopsis, fet que es correlacionava amb els estudis previs d'expressió dels gens corresponents. Tanmateix, estudis de fraccionament subcel·lular a partir de cèl·lules de la línia T87 van demostrar que aquestes isoformes es trobaven en fraccions diferents: si bé l'HMGR1S es trobava bàsicament en una fracció que sedimenta a 16.000xg, l'HMGR1L s'enriquia en una fracció que sedimenta a 105.000xg. Estudis de localització subcel·lular emprant fusions amb la proteïna fluorescent verda (GFP) van determinar que, si bé la isoforma HMGR1S es localitza principalment en estructures vesiculars de 0.5-2 mi/m, la isoforma HMGR1L es troba exclusivament en el RE. Aquesta localització subcel·lular diferencial entre ambdues isoformes ve determinada per la presència d'una extensió N-terminal de 50 aminoàcids (1Lextra) en la isoforma HMGR1L. Per tant, la regió N-terminal citosòlica constitueix una regió que determina la localització subcel·lular de l'enzim, funció que ha de venir mediada per proteïnes que hi interaccionin específicament. Amb l'objectiu de cercar proteïnes que interaccionin amb la regió N-terminal citosòlica de l'HMGR1L, es va realitzar un crivellatge per doble híbrid d'una genoteca d'expressió d'Arabidopsis. D'aquesta manera, es van identificar les proteïnes PR2A1, PR2A2 i KLC1, i es va procedir a la seva caracterització. D'una banda, es va verificar que PR2A1 i PR2A2 eren subunitats reguladores B'' de la proteïna fosfatasa 2A (PP2A). Tanmateix, es va determinar que PR2A1 i PR2A2 interaccionaven selectivament amb la regió N-terminal citosòlica de les isoformes HMGR1L i HMGR1S, però no amb la de l'HMGR2. Finalment, es va constatar que la interacció de les isoformes HMGR1L i HMGR1S amb la PR2A1 és modulada per calci. Les dades suggereixen que la PP2A podria formar part de la cascada de senyalització subcel·lular que permetria ajustar l'activitat HMGR als estímuls ambientals i de desenvolupament. D'altra banda, es va constatar que KLC1 presentava similitud amb la cadena lleugera de quinesina de tipus I, i en conservava una estructura modular equivalent. A més, es va determinar que KLC1 interacciona amb la regió N-terminal citosòlica de la isoforma HMGR1L, però no amb la de l'HMGR1S ni l'HMGR2. També es va comprovar que la regió 1Lextra, que determina la localització de l'HMGR1L en el RE, és imprescindible per aquesta interacció. Aquest fet suggereix que KLC1 podria jugar un paper en la localització subcel·lular de la isoforma HMGR1L. En conjunt, les dades de localització subcel·lular i d'interacció amb les proteïnes PR2A1, PR2A2 i KLC1, permeten postular un model d'especialització funcional de les isoformes HMGR1S i HMGR1L en el qual la biosíntesis de mevalonat es produiria segregada en dos compartiments subcel·lulars: el RE i les estructures vesiculars, les quals constituirien un nou compartiment de biosíntesis d'isoprenoides en plantes.
- TesiAnàlisi molecular de la biosíntesi d'isoprenoides a "Arabidopsis".(Universitat de Barcelona, 2009-11-27) Cairó Calzada, Albert; Boronat i Margosa, Albert; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[cat] La present tesi doctoral ha aprofunfitzat en el coneixement de la regulació de la biosíntesi d'isoprenoides a Arabidopsis. Els isoprenoides es sintetitzen a partir dels precursors isopentenil difosfat i del seu isòmer al·lilic, el dimetilalildifosfat. En plantes existeixen dues rutes de síntesi d'aquests precursors, la ruta del metileritritol fosfat (MEP), localitzada en els plàstids, i la ruta del mevalonat (MVA), localitzada en el citosol. L'enzim 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfat sintasa (DXS) catalitza la primera reacció de la ruta del MEP, i a Arabidopsis existeixen tres gens que codifiquen per possibles isoformes d'aquest enzim, DXS1, DXS2 i DXS3. Pel que fa a DXS1, la seva activitat ja habia estat demostrada, mentre que DXS3 presenta una seqüència aminoacídica molt divergida i, per tant, s'ha descartat que pugui tenir activitat DXS. En aquest treball s'ha demostrat que la DXS2 tampoc té activitat DXS que possibement està evolucionant (o ha evolucionat) cap a una nova funcionalitat. D'altra banda, s'ha demostrat que la molècula 1-desoxi-D-xilulosa (DX), després de fosforilar-se a DX5P resulta tòxica pel creixement d'Arabidopsis i E. coli. Aquesta toxicitat és produïda en el citosol de la cèl·lula, i probablement és deguda a una alteració del metabolisme glucídic. Finalment, s'han aïllat 16 mutants resistents a la inhibició per fosmidomicina (FSM), un inhibidor específic de l'enzim DXR de la ruta del MEP, anomenats rif. L'anàlisi bioquímic d'aquests mutants rif ha mostrat que en la majoria de casos els nivells de proteïna DXR es troben incrementats permetent la resistència a la FSM. La identificació del lloc d'inserció del T-DNA en els mutants rif i l'estudi dels possibles gens implicats en la resistència a la FSM, ha permès concloure que existeixen multitud de processos cel·lulars que regulen la homeostàsi de la biosíntesi d'isoprenoides a Arabidopsis.
- TesiPaper de les proteïnes AtKLC-1 i AtB" en la regulació de l'HMG-CoA reductasa d' "Arabidopsis thaliana"(Universitat de Barcelona, 2006-03-02) Antolín Llovera, Meritxell; Imperial Ródenas, Santiago; Campos Martínez, Narciso; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió III)[cat] L'enzim HMG-CoA reductasa (HMGR) catalitza la primera etapa limitant en la síntesi d'isoprenoides citosòlics. En plantes, és un enzim de membrana i la seva primera destinació subcel·lular és el reticle endoplasmàtic. Estructuralment, està formada per un domini amino-terminal (que inclou una regió amino-terminal citosòlica i dos fragments transmembrana) i un domini catalític altament conservat en tota l'escala evolutiva. En totes les espècies de plantes conegudes fins al moment, existeixen isoformes de l'HMGR codificades per diferents gens. Concretament, en Arabidopsis thaliana el gen hmg1 (expressat de forma majoritària) codifica per a les isoformes HMGR1S i HMGR1L, i el gen hmg2 (expressat a arrels, plàntules i inflorescències) codifica per a la isoforma HMGR2. A nivell d'estructura primària l'HMGR1L difereix de l'HMGR1S per la presència d'una regió extra de 50 residus aminoacídics a l'extrem amino-terminal. El domini amino-terminal confereix diferents destinacions de localització subcel·lular a la proteïna. En un treball anterior, es van identificar tres proteïnes que interaccionen amb les isoformes derivades del gen hmg1: AtB"α, AtB"β i AtKLC-1. Les dues primeres interaccionen específicament amb la regió amino-terminal de les isoformes HMGR1S i HMGR1L. Les proteïnes AtB"α i AtB"β són isoformes de la subunitat B" reguladora del complex proteïna fosfatasa 2A (PP2A). En el genoma d'A. thaliana hi ha cinc seqüències que codifiquen per a isoformes de la subunitat B" que comparteixen una gran homologia. En l'estructura primària de la subunitat B" s'han identificat motius EF-Hand (implicats en la unió a calci). S'ha demostrat que tant AtB"α com AtB"β uneixen calci. La tercera proteïna identificada, AtKLC-1, interacciona específicament amb la regió amino-terminal de l'HMGR1L. S'ha determinat per assaigs de doble híbrid en llevat i, posteriorment confirmats in vitro, que la PR65, proteïna estructural del complex PP2A, interacciona específicament amb l'AtKLC-1. La regió de la PR65 suficient per a la interacció amb la subunitat B" reguladora, AtB"α, i amb l'AtKLC-1 comprèn la mateixa seqüència aminoacídica. Per tant, l'AtB"α i l'AtKLC-1 podrien competir per a l'associació amb la PR65. Així, en la cèl·lula, la PP2A podria regular d'una forma particular les isoformes HMGR1S i HMGR1L. Assaigs in vivo i in vitro demostren que la PP2A és un regulador negatiu de l'enzim HMGR. Els ions calci inhibeixen també l'activitat HMGR. Per a què es dugui a terme la repressió de l'activitat HMGR tant per calci com per PP2A, es requereix el domini amino-terminal de la proteïna. Per tant, els resultats són consistents amb què les subunitats AtB" i/o AtKLC-1 duen a terme un paper mediador en la modulació de l'HMGR per la PP2A. El domini amino-terminal de l'HMGR1S està implicat en la morfogènesi de vesícules derivades del reticle endoplasmàtic. La subunitat AtB"α i la resta del complex PP2A participen en aquest procés. El domini amino-terminal de l'HMGR1L dirigeix la proteïna a la trama de reticle endoplasmàtic. La PP2A participa també en la localització subcel·lular d'aquesta isoforma. S'ha caracteritzat una línia mutant en el gen hmg1 d'A. thaliana que mostra absència del transcrit hmg1 i una reduïda activitat HMGR. Les plantes d'aquest mutant creixen normalment en un medi de cultiu estèril i manifesten severes alteracions del desenvolupament quan són cultivades en terra. L'addició de mevalonat, producte de la reacció catalitzada per l'HMGR, no reverteix el fenotip. Les dades indiquen que el gen hmg1 duu a terme una funció no metabòlica relacionada amb l'adaptació al medi. En aquestes condicions de creixement, les estructures vesiculars induïdes per l'HMGR1S podrien tenir alguna funció essencial relacionada amb la resposta a estrès.