Biosíntesi d'isoprenoides en plantes: caracterització molecular de la farnesildifosfat sintasa d' "Arabidopsis thaliana"

Abstract

[cat] Les plantes produeixen una gran varietat de compostos isoprenoides que són essencials tant pel seu creixement i desenvolupament com per la seva relació i adaptación amb l'entorn. La biosíntesi d'isoprenoides en plantes té lloc a través d'una via metabòlica molt complexa en la que Facetil-CoA, via mevalonat, o bé el gliceraldèhid-3-fosfat i el piruvat, via metileritritolfosfat, són convertits en isopentenildifosfat, que posteriorment és utilitzat per produir prenildifosfats de diferents longituds. Aquests intermediaris són els punts de partida de múltiples ramificacions que condueixen a la síntesi de la gran diversitat d'isoprenoides finals. Encara que s'accepta que la biosíntesis d'isoprenoides ha d'estar estrictament regulada per tal de mantenir el balanç adequat d'isoprenoides en condicions fisiològiques canviants, els mecanismes que controlen aquesta via són poc coneguts. No obstant, la complexitat de la via metabòlica suggereix l'existència de múltiples punts de control a fi d'assegurar la producció dels isoprenoides adequats en diferents parts de la planta durant el seu desenvolupament. L'enzim famesildifosfat sintasa (FPS) catalitza la condensació seqüencial de dues molècules d'isopentenildifosfat, una amb dimetilal.lildifosfat i l'altra amb l'intermediari de 10 carbonis geranildifosfat, per produir el compost de 15 carbonis famesildifosfat. En plantes, el famesildifosfat és el punt de partida d'un gran nombre de ramificacions de la via que condueixen a la síntesi de tota una sèrie de derivats isoprenoides com són, per exemple, els fitoesterols, els brassinoesteroides, els dolicols, les ubiquinones, el grup hem a i les fitoalexines sesquiterpèniques. A més, el famesildifosfat és utilitzat per la prenilació de proteïnes. En conseqüència, canvis en l'activitat FPS poden alterar el flux d'isoprenoides a través de les diverses ramificacions de la via i, per tant, desenvolupar un paper clau en la regulació de tota una sèrie de funcions essencials per les plantes. En el moment d'iniciar el treball que constitueix aquesta Tesi Doctoral, es disposava de molt poca informació relativa a la FPS de plantes, i únicament havia estat clonat un cDNA codificant per la FPS d' Arabidopsis thaliana. A més, tot i que estava acceptat que hi havia síntesi d'isoprenoides específics a partir d'IPP en tres compartiments subcel.lulars, citosol-reticle endoplasmàtic, cloroplastes i mitocòndries, només s'havia detectat activitat FPS en el citosol-reticle endoplasmàtic. Amb la finalitat d'aprofundir en el coneixement de la regulació, l'organització i la compartimentació de la via de síntesi d'isoprenoides en plantes, es va iniciar el treball que es presenta a continuació, centrat en la caracterització molecular de l'enzim farnesildifosfat sintasa d' Arabidopsis thaliana . En concret, els objectius proposats van ser els següents: 1. Determinar el número de gens que codifiquen FPS a Arabidopsis thaliana i clonar-los per procedir a la seva caracterització. 2. Determinar els patrons d'expressió dels gens FPS mitjançant experiments de Northern blot i mitjançant la generació í anàlisi d' Arabidopsis transgèniques portadores de construccions que continguin les regions 5'-fianquejants dels gens FPS fusionades al gen marcador uid A d' Escherichia coli. 3. Identificar les regions del promotor implicades en el control de l'expressió dels gens FPS mitjançant l'expressió transitòria en protoplastes i l'expressió estable en Arabidopsis transgèniques de construccions que continguin fragments progressivament delecionats per l'extrem 5' de les regions 5'-flanquejants dels gens FPS fusionats al gen marcador uid A d' Escherichia coli. A més, durant el desenvolupament dels objectius proposats inicialment, es va plantejar un objectiu addicional: Estudiar l'existència d'un segon mRNA producte de l'expressió del gen FPS1, i si la isoforma FPS codificada per aquest mRNA correspon a una FPS de localització mitocondrial.