Carregant...
Fitxers
Tipus de document
TesiVersió
Versió publicadaData de publicació
Llicència de publicació
Si us plau utilitzeu sempre aquest identificador per citar o enllaçar aquest document: https://hdl.handle.net/2445/224821
Biophysical biomarkers and machine learning for a proof of concept on a panel of drugs to inhibit tumor fibroblast activation in lung cancer
Títol de la revista
Autors
Director/Tutor
ISSN de la revista
Títol del volum
Recurs relacionat
Resum
[eng] The cytoskeleton is a hierarchical network of biopolymers involved in several key pathophysiological and cellular functions, as well as in cellular adaptation to different stimuli. Furthermore, distinct cytoskeleton phenotypes are associated with a plethora of pathological states and can change upon application of drugs against these pathologies, underlying the potential use of cytoskeleton phenotypes as biomarkers. Specifically in fibroblasts, this is clearly shown as the change from fibroblast to myofibroblast features a complete and transient cytoskeleton reorganization that allows the acquisition of a well-developed contractile cytoskeleton and the formation of robust actin stress fibers. This allows it to acquire new functions such as extracellular matrix (ECM) remodeling, which is crucial for lesion resolution. However, in the context of cancer, tumor-associated fibroblasts (TAF) present an irreversible activated phenotype exerting their functions in an aberrant manner and representing the tumor as a non-repairing wound, whose consequences have a serious implication in the resistance to drug therapies. In this doctoral thesis, we hypothesized that cytoskeleton quantification can be used as a potential source of biomarkers capable of responding efficiently in pharmacological screening aimed at identifying drugs that inhibit fibroblast activation at physiological levels. To carry out this study, a detailed cytoskeleton quantification was performed with the CSKmorphometrics pipeline using fluorescence images of physiological fibroblasts (CF) and TAF stimulated with transforming growth factor β1 (TGF-β1) and labeled with phalloidin, α-smooth muscle actin (α-SMA) and DAPI. Subsequently, filter-based feature selection algorithms were applied for the identification of physical biomarkers highly related to fibroblast activation. 9 descriptors were identified that can be used as biomarkers with high accuracy (91.7%) to robustly predict fibroblast activation. Furthermore, this biomarker signature was applied in the identification of subpopulations revealing the existence of two groups of fibroblasts with different responses to TGF-β1: one with strong activation and one with a limited response. Next, we focused on the creation of pharmacological drug screening by incorporating mimetic substrates that simulated the mechanical properties of lung carcinoma. A novel genipin cross-linked lung decellularized hydrogel (L-dECM) cryosectioning procedure was developed to obtain thin sections of slide-attached hydrogels that exhibit a wide range and tunable mechanical properties as characterized by atomic force microscopy (AFM), while preserving the biochemical stimuli of native ECM. The mechanical properties of the cryosections were optimized for the development of 2D biomimetic culture substrates that simulated the mechanics of ECM-enriched areas of tumor stroma. Our signature of biomarkers and mimetic substrates allowed us to analyze the pharmacological impact on the cytoskeleton by principal component analysis (PCA). This approach positions the effect of the drug on the fibroblast activation trajectory and identifies not only its success or failure, but also variations other than the fibroblast-myofibroblast phenotype. Among our results we highlight that the use of PDGF, VEGF and FGF receptor inhibitory strategies was successful against single targets. In addition, we report for the first time the effective use of leflunomide for myofibroblastic phenotype inhibition in vitro. In conclusion, our study highlights the potential of cytoskeleton quantification as a method to provide relevant biomarkers that can improve diagnosis, disease stratification and drug discovery, as well as to understand and identify cell subpopulations displaying different pathophysiological states.
[cat] El citoesquelet és una xarxa jeràrquica de biopolímers que intervé en diverses funcions fisiopatològiques i cel·lulars clau, així com en l'adaptació cel·lular a diferents estímuls. A més, els diferents fenotips del citoesquelet s'associen a una plètora d'estats patològics i poden canviar en aplicar fàrmacs contra aquestes patologies, cosa que subjeu a l'ús potencial dels fenotips del citoesquelet com a biomarcadors. Específicament en fibroblasts, això es mostra de manera clara atès que la transformació de fibroblast a miofibroblast compta amb una reorganització del citoesquelet completa i transitòria que permet l'adquisició d'un citoesquelet contràctil ben desenvolupat i la formació de fibres d'estrès d'actina robustes. Això us permet adquirir noves funcions com la remodelació de la matriu extracel·lular (ECM), la qual és crucial per a la resolució de la lesió. No obstant això, en el context del càncer, els fibroblasts associats al tumor (TAF) presenten un fenotip activat irreversible exercint les seves funcions de manera aberrant i representant el tumor com una ferida que no es repara, amb serioses conseqüències en la resistència a les teràpies farmacològiques. En aquesta tesi doctoral, es planteja la hipòtesi de que la quantificació del citoesquelet pot ser utilitzada com una potencial font de biomarcadors capaç de respondre eficientment en el cribratge farmacològic l'objectiu del qual és la identificació de fàrmacs que inhibeixin l'activació de fibroblàstica a nivells fisiològics. Amb l'objectiu de dur a terme aquest estudi, es va realitzar una quantificació del citoesquelet detallada amb la pipeline CSKmorphometrics a partir d'imatges de fluorescència de fibroblasts fisiològics (CF) i TAF estimulats amb factor de creixement transformador β1 (TGF-β1) i marcats amb fal·loïdina, actina del múscul llis α (α-SMA) i DAPI. Posteriorment, es van aplicar algoritmes de selecció de característiques per filtres per a la identificació de biomarcadors físics altament relacionats amb l'activació dels fibroblastos. Es van identificar 9 descriptors que es poden fer servir com a biomarcadors amb una alta precisió (91.7%) per predir de manera robusta l'activació fibroblàstica. A més, aquesta signatura de biomarcadors es va aplicar a la identificació de subpoblacions revelant l'existència de dos grups de fibroblasts amb diferents respostes al TGF-β1: un amb forta activació i un altre amb resposta limitada. A continuació, centrem els nostres esforços en la creació del cribratge farmacològic incorporant substrats mimètics que simulessin les propietats mecàniques del carcinoma pulmonar. Es va desenvolupar un nou procediment de criosecció d'hidrogels descel·lularitzats de pulmó (L-dECM) reticulats amb genipina per obtenir fines seccions d'hidrogels adherits a un portaobjectes que exhibeixen un ampli rang de propietats mecàniques caracteritzades per microscòpia de força atòmica (AFM). Les propietats mecàniques de les crioseccions van ser optimitzades pel desenvolupament de substrats biomimètics de cultiu 2D que van simular la mecànica d'àrees enriquides d'ECM de l'estroma tumoral. La nostra signatura de biomarcadors i substrats mimètics va permetre analitzar l'impacte farmacològic al citoesquelet mitjançant anàlisi de components principals (PCA). Aquest enfocament posiciona l'efecte del fàrmac en la trajectòria d'activació de fibroblasts i n'identifica no només l'èxit o el fracàs, sinó també altres variacions diferents del fenotip fibroblast-miofibroblast. Els nostres resultats destaquen que la combinació d'estratègies inhibidores de receptors PDGF, VEGF i FGF es va imposar amb èxit davant l’ús de dianes de receptors únics. A més, informem per primera vegada de la utilització efectiva de la leflunomida per a la inhibició del fenotip miofibroblàstic in vitro. En conclusió, el nostre estudi destaca el potencial de la quantificació del citoesquelet com a mètode per proporcionar biomarcadors rellevants que poden millorar el diagnòstic, l'estratificació de malalties i el descobriment de fàrmacs, així com per comprendre i identificar subpoblacions cel·lulars en diferents estats fisiopatològics.
[spa] El citoesqueleto es una red jerárquica de biopolímeros que interviene en diversas funciones fisiopatológicas y celulares clave, así como en la adaptación celular a diferentes estímulos. Además, los distintos fenotipos del citoesqueleto se asocian a una plétora de estados patológicos y pueden cambiar al aplicar fármacos contra estas patologías, lo que subyace al uso potencial de los fenotipos del citoesqueleto como biomarcadores. Específicamente en fibroblastos, esto se muestra de manera clara dado que el paso de fibroblasto a miofibroblasto cuenta con una reorganización del citoesqueleto completa y transitoria que le permite la adquisición de un citoesqueleto contráctil bien desarrollado y la formación de fibras de estrés de actina robustas. Esto le permite adquirir nuevas funciones como la remodelación de la matriz extracelular (ECM), la cual es crucial para la resolución de la lesión. Sin embargo, en el contexto del cáncer, los fibroblastos asociados al tumor (TAF) presentan un fenotipo activado irreversible ejerciendo sus funciones de manera aberrante y representando el tumor como una herida que no se repara, cuyas consecuencias tienen una seria implicación en la resistencia a las terapias farmacológicas. En esta tesis doctoral, se plantea la hipótesis de que la cuantificación del citoesqueleto puede ser utilizado como una potencial fuente de biomarcadores capaz de responder eficientemente en el cribado farmacológico cuyo objetivo es la identificación de fármacos que inhiban la activación de fibroblástica a niveles fisiológicos. Con el objetivo de llevar a cabo este estudio, se realizó una cuantificación del citoesqueleto detallada con la pipeline CSKmorphometrics a partir de imágenes de fluorescencia de fibroblastos fisiológicos (CF) y TAF estimulados con factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1) y marcados con faloidina, actina del músculo liso α (α-SMA) and DAPI. Posteriormente se aplicaron algoritmos de selección de características por filtros para la identificación de biomarcadores físicos altamente relacionados con la activación de los fibroblastos. Se identificaron 9 descriptores que pueden usarse como biomarcadores que demostraron una alta precisión (91.7%) para predecir de manera robusta la activación fibroblástica. Además, esta firma de biomarcadores se aplicó en la identificación de subpoblaciones revelando la existencia de dos grupos de fibroblastos con diferentes respuestas al TGF-β1: uno con fuerte activación y otro con respuesta limitada. A continuación, centramos nuestros esfuerzos en la creación del cribado farmacológico incorporando sustratos miméticos que simularan las propiedades mecánicas del carcinoma pulmonar. Se desarrolló un novedoso procedimiento de criosección de hidrogeles descelularizados de pulmón (L-dECM) reticulados con genipina para obtener finas secciones de hidrogeles adheridos a un portaobjetos que exhiben un amplio rango de propiedades mecánicas caracterizadas por microscopía de fuerza atómica (AFM), a la vez que preservan los estímulos bioquímicos de la ECM. Las propiedades mecánicas de las criosecciones fueron optimizadas para el desarrollo de sustratos biomiméticos de cultivo 2D que simularon la mecánica de áreas enriquecidas de ECM del estroma tumoral. Nuestra firma de biomarcadores y sustratos miméticos permitió analizar el impacto farmacológico en el citoesqueleto mediante análisis de componentes principales (PCA). Este enfoque posiciona el efecto del fármaco en la trayectoria de activación de fibroblastos e identifica no solo su éxito o fracaso, sino también otras variaciones diferentes al fenotipo fibroblasto-miofibroblasto. Nuestros resultados destacan que la combinación de estrategias inhibidoras de receptores PDGF, VEGF y FGF se impuso exitosa frente al uso de receptores únicos. Además, informamos por primera vez de la utilización efectiva de la leflunomida para la inhibición del fenotipo miofibroblástico in vitro. En conclusión, nuestro estudio destaca el potencial de la cuantificación del citoesqueleto como método para proporcionar biomarcadores relevantes que pueden mejorar el diagnóstico, la estratificación de enfermedades y el descubrimiento de fármacos, así como para comprender e identificar subpoblaciones celulares en diferentes estados fisiopatológicos
[cat] El citoesquelet és una xarxa jeràrquica de biopolímers que intervé en diverses funcions fisiopatològiques i cel·lulars clau, així com en l'adaptació cel·lular a diferents estímuls. A més, els diferents fenotips del citoesquelet s'associen a una plètora d'estats patològics i poden canviar en aplicar fàrmacs contra aquestes patologies, cosa que subjeu a l'ús potencial dels fenotips del citoesquelet com a biomarcadors. Específicament en fibroblasts, això es mostra de manera clara atès que la transformació de fibroblast a miofibroblast compta amb una reorganització del citoesquelet completa i transitòria que permet l'adquisició d'un citoesquelet contràctil ben desenvolupat i la formació de fibres d'estrès d'actina robustes. Això us permet adquirir noves funcions com la remodelació de la matriu extracel·lular (ECM), la qual és crucial per a la resolució de la lesió. No obstant això, en el context del càncer, els fibroblasts associats al tumor (TAF) presenten un fenotip activat irreversible exercint les seves funcions de manera aberrant i representant el tumor com una ferida que no es repara, amb serioses conseqüències en la resistència a les teràpies farmacològiques. En aquesta tesi doctoral, es planteja la hipòtesi de que la quantificació del citoesquelet pot ser utilitzada com una potencial font de biomarcadors capaç de respondre eficientment en el cribratge farmacològic l'objectiu del qual és la identificació de fàrmacs que inhibeixin l'activació de fibroblàstica a nivells fisiològics. Amb l'objectiu de dur a terme aquest estudi, es va realitzar una quantificació del citoesquelet detallada amb la pipeline CSKmorphometrics a partir d'imatges de fluorescència de fibroblasts fisiològics (CF) i TAF estimulats amb factor de creixement transformador β1 (TGF-β1) i marcats amb fal·loïdina, actina del múscul llis α (α-SMA) i DAPI. Posteriorment, es van aplicar algoritmes de selecció de característiques per filtres per a la identificació de biomarcadors físics altament relacionats amb l'activació dels fibroblastos. Es van identificar 9 descriptors que es poden fer servir com a biomarcadors amb una alta precisió (91.7%) per predir de manera robusta l'activació fibroblàstica. A més, aquesta signatura de biomarcadors es va aplicar a la identificació de subpoblacions revelant l'existència de dos grups de fibroblasts amb diferents respostes al TGF-β1: un amb forta activació i un altre amb resposta limitada. A continuació, centrem els nostres esforços en la creació del cribratge farmacològic incorporant substrats mimètics que simulessin les propietats mecàniques del carcinoma pulmonar. Es va desenvolupar un nou procediment de criosecció d'hidrogels descel·lularitzats de pulmó (L-dECM) reticulats amb genipina per obtenir fines seccions d'hidrogels adherits a un portaobjectes que exhibeixen un ampli rang de propietats mecàniques caracteritzades per microscòpia de força atòmica (AFM). Les propietats mecàniques de les crioseccions van ser optimitzades pel desenvolupament de substrats biomimètics de cultiu 2D que van simular la mecànica d'àrees enriquides d'ECM de l'estroma tumoral. La nostra signatura de biomarcadors i substrats mimètics va permetre analitzar l'impacte farmacològic al citoesquelet mitjançant anàlisi de components principals (PCA). Aquest enfocament posiciona l'efecte del fàrmac en la trajectòria d'activació de fibroblasts i n'identifica no només l'èxit o el fracàs, sinó també altres variacions diferents del fenotip fibroblast-miofibroblast. Els nostres resultats destaquen que la combinació d'estratègies inhibidores de receptors PDGF, VEGF i FGF es va imposar amb èxit davant l’ús de dianes de receptors únics. A més, informem per primera vegada de la utilització efectiva de la leflunomida per a la inhibició del fenotip miofibroblàstic in vitro. En conclusió, el nostre estudi destaca el potencial de la quantificació del citoesquelet com a mètode per proporcionar biomarcadors rellevants que poden millorar el diagnòstic, l'estratificació de malalties i el descobriment de fàrmacs, així com per comprendre i identificar subpoblacions cel·lulars en diferents estats fisiopatològics.
[spa] El citoesqueleto es una red jerárquica de biopolímeros que interviene en diversas funciones fisiopatológicas y celulares clave, así como en la adaptación celular a diferentes estímulos. Además, los distintos fenotipos del citoesqueleto se asocian a una plétora de estados patológicos y pueden cambiar al aplicar fármacos contra estas patologías, lo que subyace al uso potencial de los fenotipos del citoesqueleto como biomarcadores. Específicamente en fibroblastos, esto se muestra de manera clara dado que el paso de fibroblasto a miofibroblasto cuenta con una reorganización del citoesqueleto completa y transitoria que le permite la adquisición de un citoesqueleto contráctil bien desarrollado y la formación de fibras de estrés de actina robustas. Esto le permite adquirir nuevas funciones como la remodelación de la matriz extracelular (ECM), la cual es crucial para la resolución de la lesión. Sin embargo, en el contexto del cáncer, los fibroblastos asociados al tumor (TAF) presentan un fenotipo activado irreversible ejerciendo sus funciones de manera aberrante y representando el tumor como una herida que no se repara, cuyas consecuencias tienen una seria implicación en la resistencia a las terapias farmacológicas. En esta tesis doctoral, se plantea la hipótesis de que la cuantificación del citoesqueleto puede ser utilizado como una potencial fuente de biomarcadores capaz de responder eficientemente en el cribado farmacológico cuyo objetivo es la identificación de fármacos que inhiban la activación de fibroblástica a niveles fisiológicos. Con el objetivo de llevar a cabo este estudio, se realizó una cuantificación del citoesqueleto detallada con la pipeline CSKmorphometrics a partir de imágenes de fluorescencia de fibroblastos fisiológicos (CF) y TAF estimulados con factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1) y marcados con faloidina, actina del músculo liso α (α-SMA) and DAPI. Posteriormente se aplicaron algoritmos de selección de características por filtros para la identificación de biomarcadores físicos altamente relacionados con la activación de los fibroblastos. Se identificaron 9 descriptores que pueden usarse como biomarcadores que demostraron una alta precisión (91.7%) para predecir de manera robusta la activación fibroblástica. Además, esta firma de biomarcadores se aplicó en la identificación de subpoblaciones revelando la existencia de dos grupos de fibroblastos con diferentes respuestas al TGF-β1: uno con fuerte activación y otro con respuesta limitada. A continuación, centramos nuestros esfuerzos en la creación del cribado farmacológico incorporando sustratos miméticos que simularan las propiedades mecánicas del carcinoma pulmonar. Se desarrolló un novedoso procedimiento de criosección de hidrogeles descelularizados de pulmón (L-dECM) reticulados con genipina para obtener finas secciones de hidrogeles adheridos a un portaobjetos que exhiben un amplio rango de propiedades mecánicas caracterizadas por microscopía de fuerza atómica (AFM), a la vez que preservan los estímulos bioquímicos de la ECM. Las propiedades mecánicas de las criosecciones fueron optimizadas para el desarrollo de sustratos biomiméticos de cultivo 2D que simularon la mecánica de áreas enriquecidas de ECM del estroma tumoral. Nuestra firma de biomarcadores y sustratos miméticos permitió analizar el impacto farmacológico en el citoesqueleto mediante análisis de componentes principales (PCA). Este enfoque posiciona el efecto del fármaco en la trayectoria de activación de fibroblastos e identifica no solo su éxito o fracaso, sino también otras variaciones diferentes al fenotipo fibroblasto-miofibroblasto. Nuestros resultados destacan que la combinación de estrategias inhibidoras de receptores PDGF, VEGF y FGF se impuso exitosa frente al uso de receptores únicos. Además, informamos por primera vez de la utilización efectiva de la leflunomida para la inhibición del fenotipo miofibroblástico in vitro. En conclusión, nuestro estudio destaca el potencial de la cuantificación del citoesqueleto como método para proporcionar biomarcadores relevantes que pueden mejorar el diagnóstico, la estratificación de enfermedades y el descubrimiento de fármacos, así como para comprender e identificar subpoblaciones celulares en diferentes estados fisiopatológicos
Matèries
Matèries (anglès)
Citació
Citació
MARTÍNEZ BLANCO, África. Biophysical biomarkers and machine learning for a proof of concept on a panel of drugs to inhibit tumor fibroblast activation in lung cancer. [consulta: 10 de gener de 2026]. [Disponible a: https://hdl.handle.net/2445/224821]