Ús de noves metodologies per a la caracterització molecular completa en pacients amb leucèmia limfoblàstica aguda pediàtrica de llinatge B

Abstract

[cat] Antecedents: La leucèmia limfoblàstica aguda de cèl·lules B (LLA-B) es caracteritza per una elevada heterogeneïtat biològica i d’alteracions genètiques. En els darrers anys, la genètica ha esdevingut essencial per al diagnòstic, la classificació biològica i l’estratificació pronòstica dels pacients. Tot i això, en un 20–30 % dels casos no es detecten alteracions genètiques drivers mitjançant les tècniques convencionals, aquests pacients es classifiquen com a LLA-B other. Els avenços en seqüenciació massiva han millorat considerablement la identificació d’aquestes alteracions. En particular, la seqüenciació d’ARN (RNA-seq) s’està consolidant com una eina útil per detectar gens de fusió i perfils d’expressió específics. Com a conseqüència, les classificacions més recents de l’OMS i l’ICC han incorporat nous subtipus de LLA-B definits per mutacions, gens de fusió o signatures transcriptòmiques. Malgrat això, la detecció de gens de fusió continua representant un repte, ja que no existeix consens sobre l’anàlisi bioinformàtica de les dades, fet que condiciona diferències en la sensibilitat i especificitat dels algoritmes disponibles. Per tant, és necessari continuar identificant nous biomarcadors que permetin millorar el diagnòstic i el pronòstic d’aquests pacients. Hipòtesi: L'anàlisi del transcriptoma, mitjançant la seqüenciació de l'ARN missatger (mRNA-seq) i eines de bioinformàtica sensibles i precises, permetrà una caracterització biològica exhaustiva dels pacients amb LLA-B other, la qual cosa ajudarà a identificar nous biomarcadors que puguin ser útils com a a) factors pronòstics, b) objectius per al seguiment de la malaltia residual mesurable i c) objectius terapèutics. Això permetrà un diagnòstic integral i un tractament dirigit que redueixi la toxicitat i s'adapti al risc real de cada pacient. Objectiu: Aplicar tècniques sensibles per identificar nous biomarcadors en pacients prèviament classificats com LLA-B other, amb l'objectiu de millorar la seva classificació i identificar biomarcadors pronòstics potencials, dianes terapèutiques i/o dianes de seguiment. Mètodes: En el primer estudi vam desenvolupar Fusion InPipe, un algoritme bioinformàtic basat en la integració i estandardització dels resultats de cinc eines de detecció de gens de fusió. Es van avaluar la sensibilitat, especificitat i F1-score dels algoritmes individuals i de l’algoritme desenvolupat, validant-lo amb dades de catorze línies cel·lulars i quinze pacients amb leucèmia prèviament caracteritzats genèticament. En el segon estudi s’aplicà l’anàlisi transcriptòmica mitjançant mRNA-seq en una cohort de 60 pacients pediàtrics amb LLA-B other. Per detectar gens de fusió es va utilitzar Fusion InPipe i es van analitzar els perfils d’expressió mitjançant l’anàlisi t-SNE. Aquesta informació es va integrar amb les dades moleculars obtingudes al diagnòstic per classificar correctament els pacients. Resultats: En el primer estudi, Fusion InPipe va demostrar un millor rendiment que les pipelines individuals, identificant un major nombre de gens de fusió. A més, l’aplicació d’un filtre inicial que retenia només les fusions detectades per almenys tres dels cinc algoritmes va reduir significativament els falsos positius sense perdre sensibilitat. En el segon estudi, l’RNA-seq va permetre identificar gens de fusió en el 68 % dels pacients, incloent-hi sis fusions descrites per primera vegada, així com perfils d’expressió específics en el 75 % dels casos. La integració d’aquestes dades amb les tècniques convencionals va permetre classificar el 72 % dels pacients en 11 nous subtipus de LLA-B i obtenir una estratificació pronòstica més precisa en el 42 % dels casos. Conclusió: Aquesta tesi aporta noves perspectives sobre la genètica de la LLA-B other i posa de manifest la necessitat d’incorporar tècniques més sensibles, com l’RNA-seq, per detectar alteracions genètiques no identificades mitjançant els mètodes convencionals. A més, s’ha desenvolupat una eina bioinformàtica robusta que facilita l’anàlisi d’aquestes dades. En conjunt, els resultats demostren que l’RNA-seq permet una caracterització molecular integral dels pacients amb LLA-B i afavoreix un abordatge clínic més personalitzat.

[eng] Introduction: B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is characterized by high biological heterogeneity and a broad spectrum of genetic alterations. Genetic characterization is essential for diagnosis, biological classification, and risk stratification. However, in 20–30% of patients, no driver alterations are identified using conventional diagnostic techniques, and these cases are classified as B-other ALL. Recent advances in next-generation sequencing, particularly RNA sequencing (RNA-seq), have improved the detection of fusion genes and specific expression profiles. Consequently, recent WHO and ICC classifications have incorporated novel B-ALL subtypes defined by genetic and transcriptomic features. Nevertheless, fusion gene detection remains challenging due to variability among bioinformatic algorithms, which affects sensitivity and specificity. Therefore, the identification of novel biomarkers remains necessary to improve diagnosis and prognosis. Hypothesis: Transcriptome analysis using messenger RNA sequencing (mRNA-seq) combined with sensitive bioinformatic tools will enable a comprehensive biological characterization of B-other ALL patients and facilitate the identification of novel prognostic biomarkers, therapeutic targets, and measurable residual disease markers. Objective: To identify novel biomarkers in patients classified as B-other ALL in order to improve biological classification and identify potential prognostic biomarkers, therapeutic targets, and follow-up markers. Methods: The first study focused on the development of Fusion InPipe, a bioinformatic pipeline integrating the results of five fusion detection algorithms. Its performance was evaluated by assessing sensitivity, specificity, and F1-score using fourteen leukemia cell lines and fifteen genetically characterized leukemia patients. The second study involved transcriptomic analysis by mRNA-seq in a cohort of 60 pediatric B-other ALL patients. Fusion genes were identified using Fusion InPipe, while expression profiles were analyzed using t-SNE and integrated with molecular diagnostic data. Results: Fusion InPipe achieved the highest F1-score, outperforming individual pipelines while reducing false positives. RNA-seq identified fusion genes in 68% of patients, including six novel fusions, and specific expression profiles in 75% of cases. Integrating RNA-seq with conventional diagnostic techniques enabled classification of 72% of patients into 11 novel B-ALL subtypes and improved prognostic stratification in 42% of cases. Conclusion: This thesis demonstrates that RNA-seq combined with robust bioinformatic approaches improves the molecular characterization, diagnosis, prognosis, and personalized management of B-other ALL patients.