Avenços metodològics en la detecció de virus entèrics en aigües

Abstract

[cat] Els tres primers capítols es dediquen al desenvolupament i aplicació del mètode Viraden. En el primer es prova d'optimitzar el mètode basant-nos en la modificació del medi overlay, per addició d'ions multivalents i/o de tripsina-EDTA o per addició del compost iode-deoxiuridina (IDU) al cultiu cel·lular en creixement. L'addició d'IDU millora la recuperació d'enterovirus.El mètode Viraden pot aplicar-se per a la detecció de clapes víriques damunt els filtres d'èsters de cel·lulosa emprant diferents tècniques moleculars, la hibridació amb sondes d'àcid nucleic i la immunodetecció. Ambdues tècniques permeten la detecció de les zones de lisi sobre el suport però hi ha una manca en la capacitat d'identificació que permeti una classificació ràpida dels diferents enterovirus.L'adaptació del mètode Viraden a filtres de 90 mm de diàmetre permet una major aplicació del mètode per a diferents tipus de mostres ambientals.Es desenvolupen diferents sistemes de clarificació i descontaminació basats en agents químics i en membranes filtrants. La descontaminació amb fenol combinada amb clarificació per filtració a través de filtres de baixa adsorció proteica (PVDF) de 0,65 µm de diàmetre de porus és un bon sistema per a la descontaminació de mostres d'efluent secundari quan s'aplica posteriorment l'enumeració de virus pel mètode Viraden. La filtració a través de filtres esterilitzants (0,22 µm) de baixa adsorció proteica (PVDF o PES) és un mètode vàlid per a l'obtenció de mostres descontaminades. Per a volums grans de mostres d'efluent secundari, riu i mar es recomana la clarificació per filtració a través de filtres de 0,65 µm PVDF. Es valora la possibilitat d'aplicar el mètode Viraden per a la realització de test de desinfectants i antisèptics amb els virus adsorbits sobre un suport. Es compara l'acció de diferents desinfectants i antisèptics (clor, iode i glutaraldehid) sobre els virus adsorbits i en suspensió. Es detecta una diferència de 2 logaritmes entre els virus adsorbits i els virus en suspensió. Els virus adsorbits amb HR alta (>80%) persisteixen més que els virus en suspensió i aquests més que els virus adsorbits i mantinguts amb HR baixa (<50%). Es descriu un nou mètode d'enumeració de virus cultivables consistent en la realització d'una doble capa. Sobre un cultiu confluent de cèl·lules es disposa una barreja composta per la suspensió viral a analitzar, una suspensió cel·lular (igual o diferent a la de la monocapa) i el medi overlay que conté agar. El mètode es compara amb altres mètodes d'enumeració de virus i en tots els casos apareix com el mètode que permet una major recuperació de virus, tant en suspensions de cultius purs de diferents enterovirus com en mostres ambientals. Quan s'utilitza la línia cel·lular CaCo-2 per a la preparació de la suspensió cel·lular s'obtenen majors recomptes de virus a partir de mostres d'aigua residual bruta i el tipus de virus diferents que s'identifiquen a partir d'aquest tipus de mostra és major. Els virus cultivables sobre BGM en aigua residual bruta presenten increments en les densitats de virus durant els mesos de primavera. En aigua de mar els enterovirus correlacionen amb colifags somàtics (0,98). En el 76% de les mostres d'aigua de platja que compleixen amb els paràmetres microbiològics de qualitat bacteriològics inclosos a la Directiva 76/160/CEE es detecten enterovirus infecciosos en 10 litres. A partir dels aïllaments d'enterovirus de mostres ambientals es procedeix a la seva identificació mitjançant tècniques de RT-PCR i RFLP i els resultats mostren que es detecten serotips d'enterovirus dels grups poliovirus, echovirus i coxsackievirus B.