Tesis Doctorals - Departament - Microbiologia

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Bacteriofágos de bacterias entéricas en aguas de baño
(Universitat de Barcelona, 2000) Contreras Coll, Núria; Lucena Gutiérrez, Francisco; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[spa] En el contexto socioeconómico de la utilización del agua recreativa, la importancia del turismo es considerable en términos de su tamaño, impacto en esferas socioeconómicas y ambientales y la responsabilidad y recursos para intervenir que tiene a su disposición. Así, para el sector turístico, tanto en la Unión Europea como en el resto del mundo, la disposición de agua superficial limpia y “segura” para el baño o recreo es un argumento importante para atraer a los visitantes. Igual de importante es la protección de la salud de la población autóctona en las aguas recreativas. En el origen de la contaminación encontramos principalmente las descargas de ríos, agua residual y colectores directamente en las áreas de costa, y emisarios que conducen el agua residual una distancia variable de la línea de costa. Estas descargas pueden transportar una carga importante de microorganismos de diversos orígenes incluyendo agua residual urbana (tratada o no, retenida durante un tiempo o no) y de granjas de animales. Las aguas recreativas pueden contener una mezcla de microbios patógenos y no patógenos derivados de: vertidos de agua residual, la propia población que utiliza el agua (defecación y/o secreciones), procesos industriales, granjas, vida salvaje, además de cualquier microorganismo indígena. Esta mezcla puede representar un peligro para el bañista cuando una dosis infecciosa del patógeno coloniza un lugar de crecimiento adecuado en el cuerpo y conduce a enfermedad. En el caso de enfermedades transmitidas por la ruta fecal-oral este sitio es el canal alimentario, pero podría incluir también otros lugares potenciales de infección tales como los oídos, ojos, cavidad nasal y tracto respiratorio superior. En este sentido, el presente trabajo (enmarcado dentro del proyecto europeo Nº SMT4-CT95-1603) estudia el papel de los bacteriófagos en el control de tales contaminantes presentes en las aguas de baño. Se han analizado entre otros puntos los siguientes: 1) Evidencia de la necesidad de concentrar bacteriófagos en aguas de baño. 2) Elección y adaptación de un método de concentración para bacteriófagos: a. Válido para aguas dulces y aguas marinas. b. Aplicable a volúmenes de hasta 1000 ml. c. Capaz de concentrar colifagos somáticos, fagos F-específicos y fagos de Bact. fragilis con una eficiencia aceptable. d. Simple, barato y de fácil aplicación en laboratorios de rutina. 3) Verificación de la reproducibilidad del método de concentración: a. El método funciona con materiales de referencia de bacteriófagos y es reproducible con muestras naturales. b. El método es transferible a y reproducible en otros laboratorios europeos. 4) Ecología de bacteriófagos: a. Cuantificación de bacteriófagos en aguas de baño de diferente calidad. b. Estudio de las relaciones de bacteriófagos y bacterias indicadoras en agua residual y en aguas de baño. c. Estudios de supervivencia de bacteriófagos en agua de mar. d. Presencia de bacteriófagos en sedimentos marinos. e. Estudio de virus entéricos en agua de mar.
Caracterització immunogènica d'Aeromonas salmonicida respecte a la proteïna de la capa-A i al lipopolisacàrid
(Universitat de Barcelona, 1988-04-15) Blanch i Gisbert, Anicet; Jofre i Torroella, Joan; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[spa] Aeromonas salmonicida es el agente causante de la enfermedad infecciosa en los salmónidos, conocida como furunculosis. En este estudio se caracterizaron antigénicamente diversos aislamientos de esta bacteria, respecto a los factores de virulencia celulares (el lipopolisacárido y la capa-A). Posteriormente se seleccionó una capa representante para cada una de las cuatro combinaciones antigénicas posibles, determinadas por la presencia o por la ausencia de cada antígeno valorado. Cada una de ellas fue utilizada como una vacuna experimental de células completas e inactivadas. Las vacunas se utilizaron en una población del salmónido Salvelinus fontinalis, comparándose dos vías de administración. Se estudió la inmunorespuesta inducida en los ejemplares vacunados y se valoró la protección adquirida por dicha población cuando se reproducía experimentalmente una furunculosis. Se detectó por primera vez el mutante negativo para el antígeno-O del lipopolisacárido y positivo para la capa-A. Ninguna de las vacunas protegió a Salvelinus fontinalis, aunque se apreció un aumento significativo del título de aglutinación en el suero de los ejemplares inmunizados. No se presentó ninguna diferencia entre el uso de dos vías de administración (inyección intracelomática e inmersión).
Aislamiento y caracterización de Pseudomonas aeruginosa procedentes de distintos habitats: aspectos ecológicos y sanitarios
(Universitat de Barcelona, 1982-01-01) Marqués Villavecchia, Ana M.; Simón Pujol, Ma. Dolores; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[spa] Pseudomonas aeruginosa es un microoganismo Gram-negativo, potencialmente patógeno, agente causal de serias infecciones en el hombre que cursan con gran variedad de síntomas (HOMMA, 1971). Entre sus principales características destacan su elevada resistencia a los agentes antimicrobianos y su potencial metabólico, siendo capaz de utilizar un número muy elevado de compuestos (LIU, 1976; STANIER et al., 1977). La existencia en el medio ambiente de bacterias patógenas multirresistentes, como P. aeruginosa, puede significar un insospechado peligro para el hombre. Las implicaciones de la presencia y origen de estos microorganismos son cuestiones importantes que deben seírcontestadas (COLWELL y SIZEMORE, 1974). Para entender el comportamiento de un microorganismo patógeno oportunista como P, aeruginosa y poderlo combatir de forma efectiva, es necesario estudiar su ciclo y las relaciones que presenta en el medio ambiente, pudiendo llegar de esta forma a conocer sus vías de transmisión (HOADLEY, 1977, YOUNG, 1977). El fin de esta tesis es eliminar algunas barreras existentes en el campo de la Microbiología, presentando una información conjunta esencial para el entendimiento de la P. aeruginosa. En esta memoria se estudian algunos aspectos de su biología, sobre todo los que hacen referencia a su resistencia ante agentes antimicrobianos. Su incidencia y nivel de resistencia puede significar un verdadero reto para la salud pública.
Multiplicación en estado integrado y efecto protector frente a la irradiación ultravioleta del factor S de citrobacter intermedium C3
(Universitat de Barcelona, 1970-01-01) Guerrero, Ricardo, 1943-; Parés i Farràs, Ramon, 1927-2018; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[spa] La interacción entre los hechos y las ideas ha caracterizado el continuo progreso científico de los últimos cuatro siglos. En biología esta interacción se hace aún más patente, dado que la naturaleza compleja de los fenómenos vitales requiere una inmediata interpretación de los hechos experimentados, En la presente memoria se exponen diversos datos experimentales obtenidos a lo largo de varios años de investigación, junto con las ideas que han sugerido. El conjunto de trabajos que se describen a continuación forma parte de una de las líneas de investigación que se han desarrollado en equipo en el Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Barcelona. Les resultados que van a discutirse son fenómenos estadísticos, consecuencia de la integración de la actividad de millones de microorganismos. A través de ellos, y por un método necesariamente indirecto, se ha tratado de inferir la actividad de cada individuo. El trabajo experimental descrito en la presente memoria se inició en el mes de octubre de 1965, al integrarnos en las actividades del Departamento de Microbiología, que se hallaba en su primera fase de desarrollo. En estos momentos, el análisis de la segregación de glutamato por C. intermediumC 3 es un tema de investigación cuya amplitud es mucho mayor que lo que pueda corresponder a una determinada tesis doctoral. El director de esta, el Dr. R. Parés Farrás, ha realizado la función de director de un equipo de investigación en el que teníamos un especial y definido papel que llevar a cabo, comenzando por unos experimentos concretos y abordando progresivamente una serie de problemas en los que la investigación iba tomando más personalidad. El mismo sistema se ha seguido en cuanto a la discusión y elaboración de resultados, que se iniciaron mucho antes de la redacción de la memoria definitiva, al preparar bajo su orientación comunicaciones, trabajos y sesiones de seminario. Debo agradecer al director de la Tesis su entusiasmo y comprensión mantenidos permanentemente a lo largo de innumerables horas de trabajo en el gabinete y laboratorio.
Evaluación de reservorios ambientales de partículas fágicas portadoras de genes resistencia a antibióticos
(Universitat de Barcelona, 2016-10-14) Calero Cáceres, William; Muniesa Pérez, Ma. Teresa; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[spa] La presente tesis doctoral tuvo como objetivo principal el estudio de la presencia y persistencia de genes de resistencia a antibióticos (ARGs) de importancia clínica en diferentes muestras ambientales, en las fracciones fágica y bacteriana. De manera específica, se abarcaron los siguientes temas: (1) El uso de los genes de resistencia a antibióticos de importancia clínica como potenciales marcadores de comparación de los patrones de resistencia a antibióticos en una población. En este estudio, se compararon el contenido de ARGs en las fracciones bacteriana y fágica en agua residual de dos regiones geográficas diferentes (Túnez y Barcelona, España); en donde se detectaron variaciones significativas en las densidades de ARGs atribuidas a los niveles de expansión de los diferentes genes de resistencia, así como a las diferencias climáticas, socioeconómicas y culturales. (2) También se evaluó la persistencia de los genes de resistencia a antibióticos en las fracciones de bacteria y bacteriófagos de agua residual; en donde se detectó una mayor persistencia de los ARGs presentes en la fracción fágica en comparación a la bacteriana frente a diferentes tratamientos de desinfección fisicoquímica e inactivación natural utilizando mesocosmos. (3) Adicionalmente, se evaluó la presencia de elevados niveles de ARGs en los lodos de depuradoras de agua residual; en donde se evidenció una movilización de los ARGs presentes en las fracciones fágica y bacteriana de las aguas residuales hacia los lodos durante los procesos de depuración. (4) También se estudiaron los niveles de ARGs presentes en un río Mediterráneo, en donde se detectaron elevados niveles de resistencia en las fracciones bacteriana y fágica en muestras de agua de río y sedimentos; también se detectaron variaciones estacionales en los niveles de ARGs. Los ARGs presentes de forma natural en los sedimentos pueden persistir durante largos períodos de tiempo bajo diferentes condiciones, confirmando su papel como reservorios ambientales de ARGs.
Estudis sobre la contaminació i desinfecció de virus entèrics en contexts d'ajuda humanitària
(Universitat de Barcelona, 2016-06-17) Guerrero Latorre, Laura; Gironès Llop, Rosina; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[cat] L’objectiu general plantejat en aquesta tesi és contribuir a millorar el control de la qualitat de l’aigua de beguda per reduir el risc de malalties infeccioses especialment en els contexts d’ajuda humanitària. Inclou una part on s'avaluen els nivells de contaminació fecal en aigües utilitzades com a fonts d’aigua potable en contexts d'ajuda humanitària: a l’àrea metropolitana de Port-au Prince, Haití, després del terratrèmol 2010 i en els camps de refugiats de Maban, Sudan del Sud, durant l’epidèmia causada pel Virus de l'Hepatitis E (VHE) l’any 2013. Els resultats del estudi a Haití reflecteixen com les aigües superficials i fonts de beguda de l’àrea metropolitana de Port-au-Prince, Haití, després del terratrèmol l'any 2010, presenten altes concentracions de virus transmesos per l'aigua. Es detecten adenovirus i norovirus humans, importants patògens causants de gastroenteritis. En el cas dels camps del Sudan del Sud afectats per l'epidèmia causada pel VHE els resultats indicaven que tot i que les fonts d'aigua eren negatives, les mostres d’aigua i aliments de les llars presentaven contaminació per adenovirus humans, identificant d'una possible ruta de transmissió viral intradomiciliar. Una segona part de la tesi consta del desenvolupament de nous filtres d’aigua ceràmics, com a tecnologia de potabilització de baix cost, per la reducció de virus contaminants. Aquest nou prototip de Filtre d’Aigua Ceràmic proposat, cuit en atmosfera reductora, millora l'eficiència d'eliminació de virus fins a 3 logaritmes, en compliment dels requisits de l'OMS per a aquestes tecnologies sense incrementar el cost del producte. I finalment, s'inclouen estudis sobre la reducció del VHE, com a virus emergent causant d'epidèmies, davant processos de desinfecció d'aigua de beguda com la radiació UV i els sobres de floculació-cloració utilitzats en crisis humanitàries. Les dades experimentals obtingudes en els experiments d’inactivació del VHE per radiació UV indiquen que una reducció de 99,99% es pot aconseguir utilitzant radiacions relativament baixes que oscil·len entre 195-269 J/m2. Aquestes radiacions són inferiors a les normalment utilitzades en els sistemes de tractament per radiació UV (400 J/m2). Pel que fa als sobres de floculació-cloració els resultats indiquen que les reduccions pel VHE són entre 0.8 i 1.6 logaritmes tot i que són dades només basades en quantificació genòmica. El bacteriòfag MS2 avaluat per a la infectivitat va mostrar reduccions logarítmiques entre 2.3 a 3.5. Aquests nivells d’eliminació viral estan per sota dels suggerits per l’OMS (4.5 logaritmes) per aquests tipus de tractaments.
Enzimas modificadoras de la pared celular vegetal. Celulasas de interés biotecnológico papelero
(Universitat de Barcelona, 2016-07-14) Cerda Mejía, Liliana A.; Pastor Blasco, Francisco I. Javier; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[spa] La pared celular vegetal se compone de celulosa, hemicelulosas y lignina, que están fuertemente entrelazados y unidos por enlaces covalentes y no covalentes. La misma representa la fuente principal de celulosa, que constituye la materia prima para la fabricación de papel y una gran variedad de productos. El principal impedimento tecnológico para la utilización de la celulosa es la ausencia de una tecnología de bajo costo que disminuya la recalcitrancia de la misma. Se han desarrollado diversos métodos fisicoquímicos y biológicos que mejoran la despolimerización de la lignocelulosa. Los objetivos del trabajo se centraron en la identificación y caracterización de enzimas con capacidad de hidrólisis, oxidación o modificación de la celulosa, y su posterior aplicación en el refinado de la pasta de papel y en general en biotecnología de la biomasa. La primera enzima identificada fue la liquenasa de Paenibacillus barcinonensis BP-23, obtenida por el método del Genome Walking. La secuencia aminoacídica deducida del gen codificante, reveló que es una proteína monodominio perteneciente a la familia 16 de glicosil hidrolasas, fue nombrada: Lic16A, la cual mostró actividad exclusiva sobre β-1,3-1,4-glucanos y estabilidad a 55ºC durante 3h en condiciones moderadas de pH. El análisis mediante cromatografía de capa fina mostró que la enzima liberaba una mezcla compleja de oligosacáridos de diferente longitud y movilidad intermedia entre celooligosacáridos. Se efectuó la secuenciación del genoma de la cepa Paenibacillus barcinonensis BP-23 por la plataforma Illumina con la técnica HiSeq 2000, se realizó el ensamblaje de novo con el programa SGA. Después del ensamblaje parcial del genoma, se identificaron cuatro xilanasas nuevas, siete arabinofurosidasas putativas y una nueva celulasa, que fue nombrada Cel6D. La secuencia aminoacídica deducida de cel6D, la nueva celulasa identificada, reveló que es una proteína multidominio de la familia 6 de glicosil hidrolasas con la estructura GH6-Fn3-CBM3. Cel6D presenta todos los residuos cruciales para la actividad catalítica y mostró actividad exclusiva sobre celulosa cristalina, preferentemente sobre PASC, indicando que es un exoglucanasa. Cel6D presenta algunas limitaciones en termoestabilidad, ya que pierde el 80% de actividad en 15 min a 55ºC. El análisis mediante cromatografía de capa fina mostró que la enzima liberaba celobiosa como único producto de hidrólisis. La ingeniería de proteína de Cel6D, reveló que la enzima truncada, Cel6D-GH6, perdía la actividad hidrolítica, mientras que la enzima truncada Cel6D-GH6Fn3 perdió el 89% de actividad. Estos resultados demostraron la importancia de todos los módulos que componen la enzima. Para evaluar la posibilidad de un efecto cooperativo entre celulasas, se estudió el sistema endo-exo entre endoglucanasas (Cel9B, Cel5A de P. barcinonensis) y la exoglucanasa (Cel6D). Se evidenció sinergismo entre Cel9B y Cel6D sobre sustratos celulósicos insolubles, mientras que no se encontró efecto sinérgico entre Cel5A y Cel6D. Se identificó una enzima con homología a LPMO’s en la cepa Paenibacillus illinoisensis, aislada de suelos subtropicales de Brasil, que fue nombrada CBP3. A pesar de la alta homología de esta enzima con LPMO’s caracterizadas no se logró obtener resultados positivos de actividad despolimerizante en los ensayos realizados sobre sustratos celulósicos de laboratorio. Sin embargo se obtuvo liberación de azúcares a partir de pastas de papel. El uso de enzimas modificadoras sin actividad hidrolítica podría facilitar la degradación de la celulosa. Otra enzima estudiada fue la expansina BsEXLX1 de Bacillus subtilis, que al ser aplicada en pastas de lino, causó una modificación en la estructura de las fibras, que presentaron una anchura incrementada. La aplicación de Cel6D de P. barcinonensis en pastas de lino ECF, potencia su respuesta al refinado. Se consiguió una aceleración de los efectos primarios y secundarios del refinado y una mayor hidratación en la matriz interna de las fibras, que favorecen los mecanismos de cohesión interfibrilar. Como resultado se obtuvo una notable mejora de las propiedades de resistencia mecánica del papel. La simultánea disminución de la densidad que causa la aplicación de la enzima es un hecho diferencial y único de la exoglucanasa Cel6D. El efecto de biorefinado producido permite catalogar a la enzima Cel6D como “coadyuvante del refinado”. Su aplicación permite reducir la energía de refinado para conseguir determinadas propiedades de resistencia.
Factores Gre de Salmonella enterica serovar Typhimurium, su papel en el control de la filosofía y patogenicidad
(Universitat de Barcelona, 2016-04-29) Gaviria Cantín, Tania Cristina; Balsalobre Parra, Carlos; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[spa] El género Salmonella, está compuesto de bacterias Gram-negativas, no esporuladas, en forma de bacilo. Salmonella tiene importante relevancia a nivel de salud pública ya que es uno de los principales patógenos entéricos tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo. En los casos de gastroenteritis notificados en España, Salmonella se posiciona en segundo lugar, después de Campylobacter. En este trabajo se utilizó como organismo modelo de estudio S. enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), que en humanos causa salmonelosis, gastroenteritis caracterizada por diarrea inflamatoria, originada normalmente tras la ingestión de alimentos o agua contaminados. Los genes de virulencia de S. Typhimurium están localizados mayoritariamente dentro de islas de patogenicidad (SPI). Los genes codificados en la SPI-1 promueben la invasión de células eucariotas, la regulación de la expresión de los genes de la SPI-1 está mediada por HiIA codificada en el gen, hilA, presente en la misma SPI-1. HiIA activa la expresión de los genes que codifican para la síntesis de un sistema de secreción de tipo 3 (T3SS) encargado de secretar e inyectar proteínas efectoras dentro de la célula hospedadora. La expresión de hilA se encuentra bajo el control de unl bucle de regulación, comprendido por las proteínas HiID, HiIC y RtsA. HiID es el regulador predominante de este sistema, mientras que HiIC y RtsA se encargan de amplificar la señal de activación. Por su parte, los genes que contiene la SPI-2, están implicados en causar infecciones sistémicas y la proliferación intracelular de la bacteria. Los factores Gre son factores que regulan la elongación de la transcripción génica en procariotas. Son conocidos por promover la actividad endorribonucleotídica de la ARN polimerasa (ARNpol) cuando ésta se encuentra en un estado de pausa por retroceso causado durante la elongación de la transcripción. A pesar de que los factores Gre han sido bien caracterizados en otras enterobacterias como Escherichia coli, en Salmonella no existen estudios que describan el papel de los factores Gre en la fisiología celular. Así, el objetivo principal de esta tesis doctoral fue estudiar el papel de los factores Gre en la fisiología y patogenicidad de Salmonella. En este estudio describimos que los factores Gre forman parte de la compleja red reguladora de la expresión de los genes de la SPI-1 y SPI-2 de Salmonella. Los resultados obtenidos indican que los factores Gre de Salmonella son esenciales para la correcta expresión de las proteínas efectoras codificadas dentro de la SPI-1 (SipA, SipC y SipD) y fuera de ella (SopE), y que también juegan un papel importante en la motilidad de la célula bacteriana, fenotipos predominantes en la patogenicidad. Se pudo determinar que la regulación de la expresión de los genes de la SPI-1 y la SPI-2 por parte de los factores Gre, es a través de la regulación transcripcional del gen hilD. La regulación mediada por los factores Gre requiere de la región 3'UTR del gen hilD. Además demostramos que la actividad antipausa de la transcripción de los factores Gre es necesaria para la correcta expresi formación de biofilm en Salmonella. Esta regulación al parecer también es ejercida en una región UTR, en este caso en la región 5’UTR del gen csgD, y es independiente de la temperatura. En análisis transcriptómicos mediante la técnica de microarrays, se observó que los factores Gre de Salmonella estarían implicados en la correcta expresión de muchos de los genes adquiridos horizontalmente (HGT) como son los genes presentes en las islas de patogenicidad, plásmidos y fagos. También se observó que existe un elevado número de genes distribuidos en diferentes categorías funcionales, que son corregulados por los factores Gre en conjunto con la proteína DksA, proteína que incrementa la fidelidad de la transcripción al disminuir la tasa de incorporación incorrecta de nucleótidos. Estos resultados indican que el patrón general de expresión génica de Salmonella es el resultado de una compleja interacción entre los factores Gre y la proteína DksA, que implica el control mutuo, competición por la unión a la ARNpol, y la acción similar u opuesta sobre la actividad de la ARNpol. Con los resultados presentados en esta tesis doctoral se puede concluir que los factores Gre forman parte de la compleja red de regulación de los genes de virulencia de Salmonella.ón de hilD.
Diversidad genética, genes de virulencia y estructuras de superficie implicadas en la patogenicidad del género Aeromonas
(Universitat de Barcelona, 2016-02-01) Cortés Cortés, Ivania Loreto; Campo, Rosa del; Balsalobre Parra, Carlos; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
Recientemente se ha reconocido la patogenicidad de Aeromonas en cuadros gastrointestinales del hombre y de los animales (Chopra y Houston, 1999; Janda et al., 2010). Se han publicado nuevos estudios que amplían el conocimiento de su taxonomía, los factores asociados a su virulencia, así como también, la frecuencia de su resistencia a los antibióticos, especialmente en las especies causantes de infecciones graves como Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae y Aeromonas veronii subsp. sobria (Albarral 2013; Ghenghesh et al., 2014; Fatima et al., 2013). Se han aislado causando procesos infecciosos graves como bacteriemias, heridas, endocarditis, meningitis y neumonías (Tequianez et al., 2005; Rodríguez et al., 2005; Fátima et al., 2013; Grim et al., 2013). Existen diferentes factores de virulencia, principalmente citotoxinas, enterotoxinas, hemolisinas, proteasas, gelatinasas, ADNasas y otros que pueden determinar su patogenicidad (Ghenghesh et al., 2014; Grim et al., 2013). En el medio ambiente, Aeromonas es muy ubicua y está ligada al ambiente acuático. Los datos epidemiológicos sugieren fuertemente que muchas de las infecciones son adquiridas a través del consumo de agua y/o alimentos contaminados (Chopra y Houston, 1999; Janda et al., 2010; Carvalho et al., 2012), aunque por el momento no se han descrito los linajes predominantes en ambos ecosistemas. La Hipótesis de esta Tesis Doctoral fue que los aislados de Aeromonas de muestras clínicas humanas que producen cuadros invasivos, poseen factores de virulencia y mecanismos de patogenicidad distintos a las muestras medioambientales, y además corresponden a linajes genéticos diferentes. Nuestro Objetivo General fue caracterizar fenotípica y genotípicamente una colección de cepas de Aeromonas de distintos orígenes en relación con su patogenicidad. Para llevar a cabo este estudio se realizó en primer lugar un estudio retrospectivo de la prevalencia y su evolución en el tiempo (1996-2014) de Aeromonas en muestras clínicas del Hospital Universitario Ramón y Cajal de Madrid. También se creó una colección de 40 cepas de diferentes orígenes [ambientales del Río Loa, Antofagasta en Chile (n=6), aguas residuales de Túnez (n=5), diarrea (n=19), bacteriemia (n=9), y neumonía (n=1)] y se les realizó diferentes análisis fenotípicos, bioquímicos y moleculares. En todas las cepas se determinó la sensibilidad a antibióticos, la presencia de factores de virulencia y su diversidad clonal mediante electroforesis en campo de pulso. Posteriormente, 15 cepas seleccionadas fueron tipadas mediante MultiLocus Sequence Typing (MLST) y en ellas también se estudió la variabilidad de la estructura de su lipopolisacárido. Finalmente en 6 cepas se analizó su adherencia a la línea celular Caco-2 y su capacidad de invasión. Los resultados mostraron que A. hydrophila (84%) es la especie más prevalente en nuestras muestras clínicas seguida por A. caviae (12%). El número de muestras con Aeromonas se ha duplicado desde 1996 hasta 2014, siendo las heces la muestra mayoritaria con diferencia. Dentro de nuestra colección de 40 cepas, no se evidenció resistencia a los antibióticos y las cepas clínicas portaban mayor número de genes de virulencia, en comparación que las ambientales. Los estudios de campo pulsado mostraron una gran diversidad genética y las 15 tipadas mediante MLST se correspondieron con STs no descritas. La estructura del LPS fue cepa-dependiente, correspondiéndose las estructuras más complejas con las cepas de origen clínico. A pesar de su origen invasivo, nuestras cepas no presentan capacidad para invadir e internalizarse dentro de las células Caco2 diferenciadas a mucosa intestinal. Finalmente, y a modo de conclusión general, podemos que al igual que ocurre en otros microorganismos, la virulencia y patogenicidad debe ser demostrada a nivel de cada cepa, ya que no se puede generalizar dentro de una misma especie, y que el estado inmunológico del huésped también juega un relevante papel en la infección por Aeromonas.
Mejora de la producción del virus de la hepatitis A mediante selección genómica y cruce molecular de cuasiespecies
(Universitat de Barcelona, 2016-01-22) Pérez-Rodríguez, Francisco Javier; Bosch, Albert; Pintó Solé, Rosa María; Pintó Solé, Rosa María; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
El virus de hepatitis A (HAV), un virus de transmisión fecal-oral, contiene un genoma de RNA de cadena sencilla y sentido positivo, cuya longitud es de 7.5 kilobases aproximadamente y que codifica para un único marco de lectura abierto. Este virus replica ineficientemente en cultivo celular. Por ello, la producción de lotes del HAV a escala industrial destinados a vacunas o kits de diagnóstico resulta muy cara. El fenotipo de lenta replicación del HAV puede explicarse por tres factores clave interrelacionados. Primero, el sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) es muy ineficiente dirigiendo la traducción. Segundo, el virus es incapaz de inhibir la síntesis de proteínas celulares. Por último, presenta un uso de codones altamente deoptimizado. En este trabajo se han aplicado a las cuasiespecies víricas conceptos procedentes la selección genómica, como parte de un proceso de “mejora vírica”. La selección genómica se basa en el uso de información genómica para predecir los valores de cría para características fenotípicas particulares. Con el objetivo de obtener una población del HAV de replicación rápida, utilizamos como material de partida dos poblaciones del virus que presentaban cambios en su uso de codones, obtenidas tras adaptar la cepa HM-175/43c a replicar en presencia de moderados y altos niveles de silenciamiento celular. La predicción de los “valores de cría” o mejora de productividad de estas poblaciones se realizó mediante secuenciación masiva ultra-profunda de dos fragmentos genómicos (parte de la región 5’NCR y la región codificante de la proteína VP1). En una de las dos poblaciones se detectaron individuos minoritarios con tres mutaciones en el IRES que le conferían una actividad significativamente superior. Por otro lado, en la misma población una minoría de los individuos mostraba cambios en algunos codones de la región codificante de VP1 que se asociaron a una mayor actividad traduccional. Para favorecer la amplificación de la fracción minoritaria de variantes con un alto “valor de cría” estimado, se siguió una doble estrategia. Por una parte, se realizó el cruce molecular de las dos poblaciones que habían sido estudiadas. Por otra parte, como la selección de los individuos minoritarios podría depender de las condiciones de multiplicidad de infección, se usó una MOI baja. Como resultado, se consiguió seleccionar una población con un fenotipo de rápido crecimiento y mayor productividad que las poblaciones de partida y, por tanto, de un gran valor añadido desde un punto de vista biotecnológico.
Avaluació d'una infestació de Gnathia maxillaris (Montagu, 1804) (Crustacea:Isopoda:Gnathiidae), a partir del seguiment i eradicació d'un brot a un sistema d'aquaris de grans dimensions
(Universitat de Barcelona, 2016-01-22) Hispano Vilaseca, Coral; Blanch i Gisbert, Anicet; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[cat] Gnathia maxillaris és un isòpode marí ectoparàsit hematòfag de peixos. Diferents brots d’infestacions han estat descrits en animals salvatges i més recentment en sistemes de producció de l’aqüicultura o en tancs d’exhibició d’aquaris. El control d’aquests brots o l’aplicació de mesures o programes d’eradicació resulten molt complexos degut a que el seu cicle biològic ha estat només parcialment descrit, no es disposa d’un coneixement detallat sobre l’ecologia de l’espècie i no existeix informació sòlida sobre tractaments terapèutics o preventius específics per aquesta parasitosi. En aquest treball es segueix el desenvolupament d’una infestació de Gnathia maxillaris en un aquari de gran volum. Per tal d’avaluar el grau d’infestació del sistema es va desenvolupar un mètode que permetés conèixer quina era la dinàmica de la població del paràsit i l’eficiència de les actuacions realitzades per controlar-lo la infestació en el sistema. Aquest mètode consistia en realitzar un mostreig freqüent en el tanc, no només a nivell quantitatiu sinó que es diferenciaven els individus segons el seu estadi larvari. En l’estudi també s’ha avaluat l’eficiència del tractament de la parasitosi amb triclorfon, al mateix temps es va estudiar la cinètica de degradació del triclorfon al llarg de la seva aplicació. Disposar d’exemplars de larves d’aquesta espècie ha permès desenvolupar un sistema pel manteniment dels diferents estadis del paràsit al laboratori. A més a més, aquest sistema de manteniment ha facilitat que es desenvolupés en condicions de laboratori el cicle biològic, i així permetre el seu estudi. S’ha complementat la descripció del cicle de vida de G.maxillaris fet per Mouchet (1928) i s’ha aportat informació per entendre les dinàmiques del paràsit en el tanc afectat. A l’hora s’ha realitzat una descripció del mascle amb l’ajut del microscopi electrònic que ha permès complementar la descripció de l’espècie realitzada per Monod (1926). El manteniment de larves al laboratori i la possibilitat de desenvolupar el cicle ens ha permès avaluar el grau d’eficiència de productes quimioterapèutics alternatius que s’han aplicat a nivell d’aqüicultura per combatre sea lice en cultius de salmó (Salmo salar). L’objectiu pràctic d’aquest treball ha estat eradicar la Gnathia maxillaris del sistema mediterrani afectat de l’Aquàrium i ha permès que cada un dels estudis realitzats han ajudat a adquirir nous coneixements sobre G.maxillaris i sobre com controlar una infestació en aquaris de gran volum i de gran complexitat en la gestió de les aigües i les poblacions d’animals.
Comprehensive analysis of Pseudomonas aeruginosa oleate-diol synthase activity
(Universitat de Barcelona, 2015-11-20) Estupiñán Romero, Mónica; Manresa Presas, Ma. Ángeles (María Ángeles); Díaz Lucea, Pilar; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia i Parasitologia Sanitàries
[spa] Estudio global de la actividad oleato diol sintasa en Pseudomonas aeruginosa El descubrimiento de nuevas aplicaciones biotecnológicas de ácidos grasos hidroxilados tales como las oxilipinas, ha proporcionado las bases para explorar nuevos mecanismos de biosíntesis de oxilipinas en procariotas, ya que durante mucho tiempo no hubo evidencias sobre la producción de oxilipinas en bacterias. En 2010, se caracterizó bioquímicamente la actividad diolsintasa en Pseudomonas aeruginosa 42A2, una cepa del medio ambiente aisladaen aguas contaminadas con residuos oleaginosos, capaz de acumular oxilipinas en el medio extracelular. Esta actividad diol sintasa ha sido descrita por primera vez en bacterias, posibilitando la obtención de oxilipinas con propiedades interesantes mediante la oxigenación de ácidos grasos monoinsaturados, preferentemente el ácido oleico. El mecanismo catalítico descrito tiene lugar a través de la dioxigenación de ácido oleico para liberar ácido (105)-hidroperoxi-(8E)-octadecenoico (105-HPOME), que se reduce al ácido (105)-hidroxi-(8E)-octadecenoico (105-HOME) a través de una reacción secundaria no enzimática, seguido por la conversión del intermediario hidroperóxido a ácido (75,105)-dihidroxi-(8E)-octadecenoico (7,10-DiHOME). Sin embargo, los genes implicados en la biosíntesis de oxilipinas y su transporte al medio extracelular, así como la relevancia biológica de estos metabolitos en esta bacteria eran desconocidos. El presente trabajo describe el primer transportador de membrana externa de oxilipinas en P. aeruginosa, la proteína ExFadLO, e identifica el operón cuyos genes codifican dos enzimas no caracterizadas hasta el momento, que participan en la actividad oleato diol sintasa actuando de forma secuencial mediante las actividades dioxigenasa del ácido oleico (105-DOX) e hidroperóxido isomerasa o diol sintasa (7,10-DS). Estas proteínas pertenecen a una nueva subfamilia de enzimas bacterianas, designadas como FadCCPs, distribuidas únicamente entre las especies de P. aeruginosa. Además, se discuten nuevos aspectos en torno a la vía evolutiva de la ruta metabólica oleato diol sintasa,y la posible relevancia biológica de la biosíntesis de oxilipinas y su metabolismo en P. aeruginosa. Por último, se propone una aproximación biotecnológica de la actividad oleato diol sintasa de P. aeruginosa para la producción de oxilipinas.
Bacterial populations and functions driving the decontamination of PAC polluted soils = Poblacions i funcions bacterianes implicades en la descontaminació de sòls contaminats amb CAPs
(Universitat de Barcelona, 2015-10-30) Tauler Ferrer, Margalida; Grifoll Ruiz, Magdalena
[eng] Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are ubiquitous in the environment due to accidental spills during use, transport and storage of petroleum and coal derivatives. Their high chemical stability and hydrophobicity confers them recalcitrance. Because of their great persistence in the environment, toxicity and carcinogenicity, these compounds are on the list of priority pollutants. The most sustainable way to remove these compounds from soil without damaging its ecological structure and function is bioremediation. This technology uses the metabolic capabilities of microorganisms to decontaminate (degrade) polluted sites. Microorganisms act on the environment interconnected by metabolic networks, in which the byproducts generated by certain populations are utilized for others as a carbon source. Until recently, the PAH biodegradation studies were conducted by exposing individual compounds to pure strains. However, to improve the technology of bioremediation is necessary to unravel how these metabolic networks function in situ. The main objective of this Thesis was to contribute to the elucidation of microbial processes occurring in situ during PAH biodegradation in soils. Thus, two main approaches were used. First, the high molecular weight (HMW) PAH-degrading community of a creosote polluted soil was selected and characterized by new enrichment method using a biphasic system consisting of mineral medium and sand coated with a creosote NAPL previously biodegraded. Once the community became stable, its degrading potential was determined. In 12 weeks, consortium UBHP was able to significantly remove the compounds from 2 to 6 rings (90% fluoranthene, pyrene 90%, 66% benz(a)anthracene and chrysene 59%) and their alkylated derivatives. Key populations of this consortium were identified, based on their responses to specific substrates, phylogenetic, functional and metabolomic profiles, and recovery in pure culture. The phylotypes who played a key role in the degradation of HMW PAHs corresponded to Sphingobium, Sphingomonas, Achromobacter, Pseudomonas and Mycobacterium. Furthermore, the microbial processes driving the PAH removal in situ during the laboratory bioestimulation of a real creosote polluted soil were investigated. The degradation kinetics of PAHs, oxy-PAHs and N-PACs, together with the formation and/or accumulation of possible acidic products were correlated with key phylotypes and community shifts. A real-time insight into the community dynamics was obtained from the combined analysis of changes in global (genes) and active (transcripts) microbial communities, both at the phylogenetic (16S rRNA) and functional (genes RHD) level. The addition of nutrients resulted in a significant and substantial biodegradation of PAHs with 2, 3, 4 and 5 aromatic rings (93%) and the N-PACs (85%) at 150 days of incubation. During the highest degradation rates there was a transient peak of accumulation of both oxy-PAH and acid metabolites, which were later removed by the microbial populations present in the soil. The nutrient addition also resulted in a higher expression levels in both functional and structural genes, and the genera involved in the disappearance of such compounds were identified as Pseudomonas, Pseudoxanthomons, Achromobacter, Sphingobium, Olivibacter and Mycobacterium.
Efecto del uso de codones en la velocidad de traducción de la región codificante de la cápside en poblaciones del virus de la hepatitis A
(Universitat de Barcelona, 2015-10-29) Hirschy, Lucía D'Andrea; Pintó Solé, Rosa María; Bosch, Albert
[spa] El virus de la hepatitis A (VHA) pertenece a la familia Picornaviridae y posee un genoma de ARN de polaridad positiva con una longitud de aproximadamente 7500 nucleótidos. El VHA como otros virus ARN existe in vivo como distribuciones dinámicas de variantes de genomas cercanamente relacionadas, conocidas como cuasiespecies. Dichos genomas están sujetos a continuos procesos de variación genética, competición, complementación, interferencia y selección, que contribuyen al dinamismo de la población y les permite adaptarse a los distintos ambientes. El VHA posee una serie de características únicas que lo diferencian del resto de los miembros de la familia Picornaviridae. Entre ellas se encuentra el hecho de que posee un IRES de tipo III en su extremo 5’NCR, el cual es una extensa estructura secundaria altamente compleja, que posee una eficiencia muy baja en dirigir la traducción. Otra característica es que el VHA no tiene la capacidad de inducir shut-off o silenciamiento de la síntesis proteica celular. Además, el VHA posee un uso de codones que ha evolucionado de manera natural para ser complementario, y en algunos casos opuesto al de las células humanas, y se conoce como uso de codones deoptimizado. Por tanto, el VHA nunca adopta como codones abundantes aquellos que son altamente utilizados por la célula hospedadora, lo cual ha sido interpretado como una estrategia sutil para evitar en la medida de lo posible la competencia por los ARNt celulares. En el presente trabajo se estudió in vivo el efecto del uso de codones en la velocidad de traducción, en dos regiones de la cápside de cuatro poblaciones del VHA adaptadas a replicar en diferentes condiciones de silenciamiento celular, inducido artificialmente con la utilización de la droga Actinomicina D (AMD). Estas cuatro poblaciones se adaptaron a replicar en ausencia de silenciamiento (L0), a niveles moderados (0.05 μg/ml de AMD, F0.05LA), a niveles altos (0.20 μg/ml de AMD, F0.2LA), y la última era una población de crecimiento rápido (HM175-HP) obtenida como resultado de un evento de molecular breeding y que estaba adaptada a replicar a niveles moderados de silenciamiento celular. Se obtuvieron cuasiespecies de cada una de las dos regiones estudiadas y para las cuatro poblaciones del VHA. Se estudió su velocidad de traducción utilizando vectores bicistrónicos que poseen clonado el IRES del VHA. Se observó que cambios puntuales en el uso de codones que inducían la aparición de codones menos frecuentes, tenían como consecuencia la disminución de la tasa de traducción, que era en mayor o menor medida dependiendo de la significancia de la pérdida de frecuencia y del contexto en el cual tenía lugar el cambio. También se vio que cambios puntuales que inducían una optimización, es decir, presencia de codones más abundantes, conllevaban a un aumento de la tasa de traducción. Asimismo, se encontró que la existencia de optimización/deoptimización concomitante en un mismo individuo o haplotipo podía tener como consecuencia la recuperación de la tasa de traducción perdida, por efecto de codones poco frecuentes o incluso un incremento significativo de la misma, dependiendo de los cambios de codones que estaban participando. Por otra parte, se introdujeron en todos los haplotipos obtenidos para las diferentes poblaciones en estudio, 3 mutaciones en el IRES, U359C, U590C y U726C, que previamente se había visto en nuestro laboratorio que incrementaban su actividad de forma significativa. Se concluyó que estas mutaciones del IRES modificaban el efecto del uso de codones en las tasas de traducción. A su vez, beneficiaban de forma muy relevante a aquellos haplotipos que habían previamente evolucionado para traducir significativamente más rápido. También tenían un efecto positivo en los haplotipos que presentaban deoptimización del uso de codones, permitiendo recuperar la tasa de traducción disminuida. Sin embargo, dichas mutaciones tendían a disminuir la traducción de aquellos haplotipos que conseguían una tasa de traducción normal por efectos compensatorios de optimización/deoptimización local de codones. En la población HM175-HP, las 3 mutaciones del IRES en combinación con un uso de codones optimizado le permitía traducir de una forma significativamente más rápida en las regiones de la cápside analizadas, contribuyendo a que HM175-HP sea una población de rápido crecimiento del VHA con un gran potencial biotecnológico.
Movilidad de factores de virulencia del patógeno E. Coli O157:H7 y otros serotipos
(Universitat de Barcelona, 2015-07-17) Martinez Castillo, Alexandre; Muniesa Pérez, Ma. Teresa
[spa] Los elementos genéticos móviles (EGMs) tienen la capacidad de transportar el ADN bacteriano y hacer que prácticamente cualquier gen presente en una bacteria pueda ser movilizado a otra. Los bacteriófagos son un tipo de EGM que permiten la movilización de genes de una cepa bacteriana a otra, pudiendo generar nuevas cepas patógenas si el gen que transfieren codifica para una proteína que provoca virulencia. En esta tesis doctoral nos hemos centrado en el estudio de los bacteriófagos portadores de genes de virulencia como EGMs. Para ello se estudió, en primera instancia, la presencia de bacteriófagos Stx2 en heces de individuos sanos, dado que se ha demostrado su presencia y capacidad de infección en alimentos aptos para el consumo humano y en aguas residuales. La presencia de fagos Stx en heces humanas aparece como la conexión entre su prevalencia en los alimentos, los cuales al ser ingeridos incorporan los fagos Stx, y su detección en agua residual, como resultado de su excreción. Se detectó la presencia de fagos Stx en las heces de individuos sanos y se evaluó su capacidad infectiva. La evolución de las cepas Shiga toxin Escherichia coli (STEC) se determinó a partir de ancestros stx-negativos y que inicialmente no poseían el resto de genes necesarios para producir la enfermedad. Por ello se estudiaron los genes de virulencia en cepas STEC ambientales, permitiendo observar los diferentes estadios intermedios en las evoluciones de las cepas STEC. Las variantes de stx encontradas fueron stx2a y stx2c, que corresponden a las variantes asociadas a mayor virulencia. El estudio de la distribución de los genes de virulencia según su origen reveló claramente que las cepas que contenían un mayor número de factores de virulencia eran cepas de origen vacuno, seguidas de las de origen humano, siendo el serotipo O157:H7 el que contenía mayor número de genes de virulencia. En general, los genes de virulencia que se detectaron con mayor frecuencia fueron aquellos que no estaban codificados en el denominado locus for enterocyte effacement (LEE). El gen más predominante fue hlyA que codifica para una enterohemolisina seguido por el gen nleC y el gen saa El desarrollo de una matriz para visualizar la distribución de los genes entre sí permitió la detección de dos agrupaciones: el grupo formado por genes codificados en LEE y otros genes como espJ, espM, nleB2, nleC, nleD, nleE, nleF, nleA, nleH1 y tccP; y los genes saa, hlya, stx1, cdt y cif que raramente se encontraban en combinación con otros genes, y probablemente se movilicen independientemente mediante algún tipo de EGM. A continuación, nos centramos en el estudio de los genes no descritos en fagos que parecía que se movilizaban de forma independiente y, más en concreto, en el gen saa. El gen saa codifica para una adhesina que se encuentra en las cepas STEC que no codifican para LEE. Se analizaron las diferentes variantes del gen en las cepas STEC saa+ aisladas y se observó y cuantificó la adherencia a células Hep2. En contacto con un agente inductor como la Mitomicina C, el número de copias del gen saa aumentaba hasta 4 unidades logarítmicas y se observó hibridación positiva con una sonda saa en calvas de lisis. Estos resultados sugieren que saa puede ser un gen movilizado por un bacteriófago o, al menos, movilizado mediante una cápside proteica. La banda de CsCl en la que se detectaba el gen saa se observó por microscopia electrónica revelando una morfología tipo Podoviridae. Se confirmó por proteómica la presencia de proteínas fágicas en la fracción de CsCl donde se detectaba saa, siendo una de ellas homóloga a proteínas tipo gene transfer agents (GTA). A sí mismo, se detectó la presencia de saa en la fracción viral de diferentes muestras de origen animal y humano. Finalmente, dado que el primer paso para que una cepa llegue a ser infectada por un fago es la unión de éste a los receptores de membrana de la bacteria provocando la activación de las respuestas de estrés de membrana, se estudiaron la influencia de los sistemas de estrés de membrana en la conversión lisogénica de la bacteria. Los resultados obtenidos indican que la vía BaeSR está implicada en la formación de lisógenos. A pesar de que los fagos Stx son un grupo muy heterogéneo, este resultado se observó con distintos fagos Stx y se determinó que este efecto se debía a los receptores de membrana BamA.
Secondary channel of the RNA polymerase, a target for transcriptional regulation in bacteria
(Universitat de Barcelona, 2015-05-11) Fernández Coll, Llorenç; Balsalobre Parra, Carlos; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[cat] El control de l’expressió gènica en bacteris recau principalment sobre un complex enzimàtic anomenat ARN polimerasa (ARNpol). A procariotes, la seva unitat bàsica (core) està formada per 5 subunitats proteiques (a2bb’w). S’han determinat dos canals entre les diferents subunitats de l’ARNpol: el canal primari, on es desenvolupa la transcripció, i el canal secundari, que comunica el medi exterior amb el centre catalític de l’ARNpol. Tot i així, aquest holoenzim necessita la unió d’una subunitat σ per ser capaç de reconèixer una seqüència promotora i iniciar la transcripció. S’han descrit diferents factors, tant proteics com no proteics, que poden interaccionar amb el canal secundari de l’ARNpol i causar alteracions a l’expressió gènica. En aquesta tesi ens hem centrat en la possible competència entre els diferents factors que poden interaccionar amb el canal secundari de l’ARNpol. Estudis anterior duts a terme en el nostre grup d’investigació, ens van permetre postular una possible competència entre els diferents factors que interaccionen amb el canal secundari de l’ARNpol, més concretament entre les proteïnes GreA i DksA. Aquesta competència provocaria alteracions en el patró d’expressió gènica d’Escherichia coli. En aquest treball s’han dut a terme estudis funcionals, estructurals i filogenètics de la proteïna GreA que ens han permès determinar quins aminoàcids, i com a conseqüència quins dominis, podrien ser importants per la funcionalitat de la proteïna, la seva capacitat d’unir-se a l’ARNpol i la seva capacitat de competir amb altres factors. A més, hem estudiat quin efecte té la competència entre els diferents factors que interaccionen amb el canal secundari sobre l’expressió d’un gen diana. Canvis en els nivells de la proteïna GreA, poden afectar la competència pel canal secundari de l’ARNpol Per això hem determinat el patró d’expressió del gen greA, així com l’existència d’una regulació creuada entre les diferents proteïnes que interaccionen amb el canal secundari. Finalment, hem dut a terme un estudi transcriptòmic en Salmonella enterica serovar Typhimurium, amb l’objectiu de determinar quin és l’efecte d’aquesta competència en l’expressió de factors de virulència.
Relación de Legionella spp. con parametros microbiológicos y fisicoquímicos en aguas
(Universitat de Barcelona, 2009-10-22) Serrano Suárez, Alejandra; Araujo Boira, Rosa Ma.; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[spa] El objetivo principal de este trabajo fue determinar los factores ecológicos tanto microbiológicos como fisicoquímicos que permitan, favorezcan o indiquen la supervivencia y multiplicación de Legionella en los sistemas acuáticos artificiales. Con este fin se realizó un estudio de la prevalencia de las diferentes cepas de Legionella que se encuentran en las instalaciones hídricas de riesgo. También se analizaron parámetros fisicoquímicos y microbiológicos que podrían relacionarse y servir como indicadores de la presencia o ausencia del patógeno. Se analizaron parámetros como la temperatura, Fe, Cu, Zn y la presencia de biocidas. Con este estudio se pretendía conseguir un mejor conocimiento del comportamiento de la bacteria y su relación con otros microorganismos y determinados parámetros fisicoquímicos en estos ambientes, lo que permitiría un mejor control del origen de los brotes y como consecuencia una mejor protección de la salud pública. Para conseguir estos resultados: • Se realizó la estandarización de métodos, para el análisis y cuantificación de Legionella y protozoos en agua sanitaria. • Se realizaron muestreos de agua sanitaria caliente y torres de refrigeración que procedían de hoteles de la costa mediterránea y de residencias de gente mayor de la ciudad de Barcelona, con un alto grado de complejidad en el diseño y funcionamiento de sus sistemas de agua. • Se determinó la presencia de Legionella y su relación con heterótrofos a 22ºC, heterótrofos a 37ºC, Pseudomonas, Aeromonas y protozoos. • Se analizaron muestras y se asesoró sobre la desinfección de un edificio público de la ciudad de Barcelona con contaminación por Legionella, identificando los puntos de muestreo representativos y aplicando el método de cultivo y la técnica de PCR semi-nested puesta a punto previamente. Para posteriormente realizar las medidas de desinfección necesarias. • Se detectaron e identificaron amebas de vida libre en las muestras de agua sanitaria caliente y Torres de refrigeración aplicando técnicas de cultivo, observación con microscopio y PCR.
Implicación de la glicosilación en el ensamblaje del flagelo y las fimbrias de Aeromonas hydrophila AH-1
(Universitat de Barcelona, 2014-06-19) Molero Andrade, Raquel; Merino Montero, Susana; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[spa] El género Aeromonas está constituido por bacilos gram negativos y comprende patógenos de animales poiquilotermos y oportunistas en humanos. La virulencia de Aeromonas hydrophila AH-1 es multifactorial, siendo el lipopolisacárido (LPS), el flagelo (polar y lateral) y la lámina S importantes factores de patogenicidad. La mutación del gen wbpL, implicado en la biosíntesis del antígeno O del LPS, da lugar a la pérdida de antígeno O, una bajada en el peso molecular de las flagelinas polares y la aparición de fimbrias en la superficie bacteriana. Se procedió a estudiar si las flagelinas polares y laterales de la cepa AH-1 se hallaban glicosiladas. Los análisis mediante LC-MS mostraron que las flagelinas laterales de la cepa AH-1 no se hallaban glicosiladas, mientras que las polares se hallaban glicosiladas con un glicano de 403 Da, derivado del ácido pseudamínico y otro glicano de 1060 Da, que no se encontraba en el mutante del gen wbpL. Este dato, junto con el hecho de que el mutante del gen rmlB que codifica para la biosíntesis de ramnosa (azúcar que compone el antígeno O) también pierde el glicano de 1060 Da, muestra la relación entre dicho glicano y el antígeno O del LPS. Asimismo se procedió a localizar los genes implicados en la síntesis de pseudamínico, adyacentes a la región 2 de flagelo polar; mutaciones tanto en alguno de estos genes (pseI, pseB) como en la glicosiltransferasa maf-1 abolía la presencia de flagelo polar pero no del lateral, demostrando así una regulación post-traduccional de las flagelinas polares mediante la glicosilación. También se observó la aparición de fimbrias. Se procedió a analizar las fimbrias que se inducían en los mutantes wbpL, pseI, pseB y maf-1. Se trata de fimbrias de tipo IV, denominadas MSHA por su homología a las descritas en Vibrio spp y ampliamente distribuidas en el género Aeromonas. La secuenciación de la agrupación mostró 22 ORF agrupadas en dos transcritos. Para analizar la inducción de las fimbrias en los mutantes se realizaron análisis de promotores, RT-PCR y detección mediante anticuerpos, que mostraron que la cepa salvaje AH-1 presenta las fimbrias pero no es capaz de ensamblarlas correctamente y las libera al exterior. La acumulación de azúcares activos en los mutantes parece ser el detonante para la expresión de estas fimbrias que juegan un papel fundamental en la formación de biofilms, favoreciendo la persistencia de la bacteria en el medio ambiente.
Disseminació i traçabilitat de la contaminació viral en conques fluvials = Dissemination and source tracking of viral contamination in river catchments
(Universitat de Barcelona, 2014-06-13) Rusiñol Arantegui, Marta; Gironès Llop, Rosina; Bofill Mas, Silvia; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[cat] Aquesta Tesi Doctoral ha estat pensada per avaluar, mitjançant l’estudi de virus contaminants, l’origen de la contaminació fecal i l’avast de la disseminació a l’aigua. Amb aquesta finalitat s’han utilitzat eines moleculars per a la detecció i quantificació de virus especifics humans, bovins i porcins i a més a més s’ha desenvolupat una nova eina per traçar la contaminació ovina a l’ambient. Els principals agents virals amb risc per als humans són d’origen humà però les femtes animals, amb potencials patògens zoonòtics, representen també un risc per a la salut humana. La intensificació de la producció animal o l’increment de plujes torrencials previst amb els escenaris proposats per al canvi climàtic presenten nous reptes per al control de la contaminació fecal a l’aigua. Bona part de la Tesi, ha anat lligada al projecte europeu VIROCLIME permetent dur a terme estudis a nivell internacional. S’ha caracteritzat la disseminació de virus humans contaminants a l’aigua d’un riu situat en una conca Mediterrània. Mitjançant el registre de variables hidro-climàtiques, la recollida de mostres d’aigua de riu, aigua de mar i aigua residual, i l’anàlisi de FIB i virus indicadors de contaminació fecal humana (HAdV i JCPyV), virus patògens (NoVGII, HEV), i un virus emergent (MCPyV), s’ha estudiat durant un any, l’impacte que l’aigua residual crua o els efluents de les depuradores tenen en la qualitat microbiològica del riu. En un segon estudi realitzat conjuntament amb laboratoris de Suècia, Grècia, Hongría i Brasil, s’ha pogut estandarditzar el mètode de floculació amb llet descremada, per a la concentració de virus, i els assajos de qPCR per identificar i traçar l’origen de la contaminació fecal a l’aigua. Durant 18 mesos de mostrejos a conques de rius situats a les regions Mediterrània, Àrtica, Continental i Tropical, s’han identificat virus humans (HAdV i JCPyV), bovins (BPyV) i porcins (PAdV), demostrant que aquestes eines virals són fiables i útils per a qualsevol àrea geogràfica o matriu d’aigua. Fins al principi d’aquesta tesi, només es disposava de marcadors virals de contaminació fecal porcina i bovina. Analitzant mostres de femta i orina d’ovella, amb un assaig de PCR d’ample espectre per a la detecció de poliomavirus, es van obtenir per primera vegada seqüències d’un putatiu nou poliomavirus oví. A partir d’aquí, s’han dissenyat dos assajos de PCR específics per poder traçar la contaminació fecal ovina a l’ambient. Arrel d’aquest treball, durant l’últim any de la tesi, es va plantejar una estada a Nova Zelanda perquè es tracta del país amb més ovelles per càpita i representa bona part de la indústria ramadera del país. Traçar i identificar l’origen de la contaminació fecal animal a l’aigua és doncs bàsic, tant per la gestió dels residus com per l’avaluació dels riscos per a la salut humana. El quart estudi inclòs a la tesi, es va dissenyar per identificar les fonts principals de contaminació fecal i avaluar, al mateix temps, les diferents eines de MST utilitzades a Nova Zelanda i al laboratori de la doctoranda. S’han recollit mostres de riu als territoris ramaders més importants de l’illa del sud, i s’han analitzat E. coli, virus específics indicadors de contaminació fecal humana (HAdV, JCPyV) bovina (BPyV) i ovina (OPyV), marcadors bacterians específics d’humans (BacH, BacHum-UCD, BiAdo) i de remugants (BacR) i esterols i estanols indicadors de contaminació fecal humana o de remugant.
Identificación del origen de la contaminación fecal en aguas con Bifidobacterium spp. y/o Bacteroides spp. específicas de huéspedes
(Universitat de Barcelona, 2014-06-06) Gómez Doñate, Marta; Muniesa Pérez, Ma. Teresa; Blanch i Gisbert, Anicet; Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia
[spa] El agua es un recurso renovable y fundamental para el sustento y desarrollo de la vida en el planeta. Debido al crecimiento de la población humana junto con la expansión de la actividad industrial, la agricultura y ganadería intensivas y el cambio climático han provocado un gran deterioro en la calidad del agua. La contaminación de origen fecal es una de las fuentes más relevantes de la polución del agua, ya que puede comportar la presencia de microrganismos patógenos, los cuales implican un alto riesgo sanitario y grandes pérdidas económicas. La discriminación del origen de la contaminación fecal es por tanto esencial para la actuación directa sobre la fuente, conocer el impacto y los riesgos derivados de dicha contaminación. Existen diversos métodos para la determinación del origen de la contaminación fecal. En primer lugar los métodos químicos, los cuales consisten en la detección de compuestos como la cafeína o los esteroles y estanoles fecales. En segundo lugar, los métodos microbiológicos (Microbial Source Tracking). Estos están enfocados a encontrar microrganismos capaces de discriminar el origen de la contaminación fecal. Se asume que estos microrganismos están relacionados con la flora gastrointestinal de cada uno de los huéspedes y que son diferentes unos de otros debido a las condiciones intestinales de cada hospedador, a la selección natural, y a que la progenie producida por subsiguientes replicaciones es genéticamente idéntica. Los primeros microrganismos utilizados (E. coli, coliformes fecales, enterococos o clostridios reductores de sulfitos) no eran capaces de determinar el origen contaminante. Por ello se desarrollaron otras metodologías con nuevos indicadores. La primera utilizada para los estudios de MST fueron la determinación de bacteriófagos que infectaban cepas de Bacteroides específicas de huésped (humano, bovino, porcino y aviar). En este primer estudio se comprueba que las cepas seleccionadas para cada origen muestran una alta detección de fagos en las muestras con carga fecal elevada de su mismo origen, no detectando fagos (salvo alguna excepción) en muestras de origen distinto. También identificaron con éxito la fuente contaminante en muestras de agua con carga fecal moderada. En el segundo estudio se diseñaron cuatro sets (cebadores comunes y sondas específicas) de qPCRs específicas de Bifidobacterium asociados a huésped. Se comprobó que los pasos previos de extracción y purificación del ADN de la muestra eran necesarios para su correcto análisis, que cada uno de los sets era capaz de discriminar su origen contaminante sin producirse reacciones cruzadas en aguas tanto de elevada como moderada carga fecal. En el tercer estudio se aplicaron estas técnicas junto con las metodologías de PCR del ADN mitocondrial y una PCR multiplex de Bif. adolescentis y Bif. dentium para la puesta a punto de un programa de aprendizaje inductivo (Ichnaea) capaz de establecer modelos predictivos para su aplicación en muestras ambientales con bajos niveles de contaminación. Para ello se estudiaron tres tipos de muestra: de elevada y moderada carga fecal, donde todos los métodos resultaron efectivos; y de baja carga fecal (canal de riego del Delta del Ebro), donde en muchos casos la diana de las metodologías se encontraba por debajo de su límite de detección. Este programa informático también estableció qué parámetros poseían mayor relevancia según el nivel de la dilución y la antigüedad de la muestra. En el último estudio se diseñó un set de qPCRs específicas de Bacteroides asociados a huésped (a partir de las bandas predominantes del ADN 16S analizadas por DGGE de cada origen fecal). Esta nueva metodología continúa en estudio. La conclusión principal de este trabajo es que no existe una metodología única y universal capaz de discriminar el origen de la contaminación fecal, si no que para una mayor fiabilidad en la discriminación es necesario el análisis conjunto de diversos indicadores y que los programas de aprendizaje inductivo indican cuáles son los más relevantes en cada caso.

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