Purificación de una actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa tipo 1 de la fracción microsomal de hígado de rata

Abstract

[spa] El enzima hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A reductasa (HMG-CoA reductasa) es el principal enzima regulador de la vía de síntesis del colesterol. Al igual que otros muchos enzimas, éste intercambia sus estados inactivo o activo por fosforilación / desfosforilación reversible, dependiendo su nivel de actividad del grado de fosforilación. En estudios "in vitro" se ha demostrado que en el mecanismo de fosforilación reversible intervienen HMG-CoA reductasa quinasas y HMG-CoA reductasa fosfatasas, tanto de origen microsomal como citosólico. Nuestro objetivo ha sido profundizar en la caracterización y purificación de las protein fosfatasas localizadas en microsomas de hígado de rata, en especial la actividad fosfatasa, que a lo largo de este trabajo denominaremos HMG-CoA reductasa fosfatasa M, ya que presenta un comportamiento cromatográfico que la diferencia de otras protein fosfatasas descritas. Los resultados obtenidos en el subfraccionamiento celular, en el fraccionamiento cromatográfico y la caracterización enzimática de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa apoyan las siguientes conclusiones: 1.- El estado nutricional de las ratas no modifica la actividad total HMG-CoA reductasa fosfatasa presente en el sobrenadante postrnitocondrial de hígado. La actividad no se ve modificada por ayuno prolongado ni por la administración de glucagon. 2.- El tratamiento con glucagon determina la redistribución de la actividad, la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa asociada a microsomas disminuye significativamente. 3.- El subfraccionamiento por centrifugación a 100.000 xg del sobrenadante postmitocondrial, obtenido de ratas alimentas, provoca la precipitación de una parte (aproximadamente el 15%) de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa inicial. Esta actividad se distribuye a partes iguales entre microsomas y precipitado de glucógeno. 4.- La actividad presente en microsomas no se debe a contaminación por proteínas de origen citosólicas. 5.- La actividad presente es microsomas no se debe a contaminación por proteínas procedentes del precipitado glucógeno-proteico ya que: a) tiene afinidad por el glucógeno; b) las pautas de solubilización son distintas para microsomas y glucógeno; c) cuando se intenta la purificación de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa a partir de glucógeno siguiendo la misma metodología que la empleada para la HMG-CoA reductasa fosfatasa M se pone de manifiesto un comportamiento cromatográfico diferenciador entre las muestras procedentes de glucógeno y las de microsomas. 6.- La distribución de PrP sobre sustrato HMG-CoA reductasa, tras la centrifugación en un gradiente de sacarosa permite concluir que existe una actividad localizada en rnicrosomas. 7.- La actividad presente en microsomas puede solubilizarse con tratamientos suaves (detergentes no aniónicos a baja concentración o tratamiento con sales a baja molaridad) sin que queden cantidades significativas en el precipitado final, lo que indica que la proteína responsable de la actividad fosfatasa no es una proteína intrínseca de membrana. 8.- En microsomas están presentes tres actividades proteína fosfatasa sobre sustrato HMG-CoA reductasa: PrP 1, PrP 2A y PrP 2C. No se detecta actividad PrP 2B en microsomas. 9.- Se purifica la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M a partir de microsomas solubilizados con detergente. La preparación final presenta un peso molecular aparente de 85 kDa en gel filtración. 10.- La actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M en presencia de 0.5 M KCl se disocia produciendo dos subunidades: una con actividad catalítica que presenta un peso molecular de aproximadamente 55 kDa, tanto en gel filtración como en geles de acrilamida/SDS y otra de menor peso molecular que es la subunidad de anclaje al retículo endoplasmático. 11.- El enzima HMG-CoA reductasa fosfatasa M no es específico para el sustrato HMG-CoA reductasa. De forma inversa el sustrato HMG-CoA reductasa puede ser desfosforilado por las cuatro serin protein fosfatasas hasta ahora descritas: PrP 1, 2A, 28 y 2C. 12.- La actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M se clasifica como PrP 1, al ser inhibida por el inhibidor 2 y al mismo tiempo no ser activable por protamina. Son necesarias para su inhibición mayores concentraciones que las descritas para la PrP 1 citosólica. 13.- La rotura del holoenzima de 85 kDa, o de la subunidad de 55 kDa, por precipitación con acetona o por proteolísis controlada con tripsina, provoca la aparición de una actividad protein fosfatasa de peso molecular en cromatografía de gel filtración de 35-37 kDa. 14.- La obtención del fragmento de 35-37 kDa conlleva en todas las ocasiones pérdida de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa que no se recupera por tratamientos posteriores. 15.- Vistas las conclusiones anteriores, el enzima HMG-CoA reductasa fosfatasa M, purificado y parcialmente caracterizado a partir de microsomas de hígado de rata, tiene un comportamiento que lo distingue de otras PrP descritas. Es de origen microsomal y no se debe a contaminación por glucógeno o citesol. Está constituido por una subunidad de anclaje y otra con actividad catalítica. En su constitución no interviene el modulador o inhibidor 2 si bien lo reconoce y es inhibida por él.

[eng] 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase (E.C. 1.1.1.34) the main rate limiting enzyme for synthesis of cholesterol and isoprenoids, has been shown to be regulated by covalent modification. AMP-activated reductase kinasa inactivates and phosporylates HMG-CoA reductase. Inactivated, homogeneous P-labelled HMG-CoA reductase is reactivated in vitro by rat liver protein phospatases with a concomitant release of P bound to serin residues. HMG-CoA reductase phosphatise activity present in the post-mithocondrial supernatant partially sedimented (13%) into the particulate fraction upon centrifugation at high speed. The sedimented activity was distributed in a similar grade level between the microsomal membranes (7%) and the gIycogen pellet (6%). The phosphatase activity associated to the endoplasmic reticulum was not due to glycogen contamination. The whole HMG-CoA reductase phospatase activity present in microsomal membranes can be isolated with either 0,1% Triton X-100 or 0.5 M KCI of which it is concluded that this activity is not associated to membrane as a integral protein. By using standard enzymatic methods can be characterized three protein phosphatase activities in the detergent solubilized microsomal membranes: type 1, 2A and 2C, but not type 2B. The purified protein HMG-CoA reductase phosphatase microsomal PrP-M characterized as type 1 requires higher concentrations of inhibitor-2 than the rabbit muscle cytosolic type 1 protein phosphatase. PrPn was not affected by the protein inhibitor that inhibits PrP type 2A activity when HMG-CoA reductase is the substrate. A model of the microsolnal PrP type-1 is presented, deduced by the molecular masses observed after solubilization either by Triton X-100 or 0.5 M KCI, and by the trypsin treatment.