Manipulating levels of carotenoid-related enzymes and transcription factors in tomato (Solanum lycopersicum L.)

Abstract

[eng] Carotenoids are essential isoprenoids in plants, primarily required for photoprotection. However, their functions vary depending on the plant species and organ, serving as pigments in many flowers and fruits and as precursors of hormones such as abscisic acid (ABA) and strigolactones (SLs) in other tissues. In humans, dietary carotenoids serve as important sources of antioxidant compounds and vitamin A. Therefore, carotenoid biofortification is a key strategy to enhance food security and improve nutrition. Carotenoids are present at relatively high levels in the fruit of agriculturally important species such as tomato (Solanum lycopersicum L.). However, our knowledge of how isoprenoid precursors are channeled into the carotenoid pathway in fruits and other organs of this important crop is still very limited.

Phytoene synthase (PSY) is a key enzyme that produces phytoene (the first intermediate in the carotenoid pathway) from geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP). In the previous step, GGPP synthases (GGPPS) synthesize GGPP from the universal isoprenoid precursors isopentenyl pyrophosphate and dimethylallyl pyrophosphate. Tomato has three genes encoding isoforms of GGPPS (here referred to as SlG1, SlG2, and SlG3) and PSY (PSY1, PSY2, and PSY3). In the first part of this thesis, we used previously generated tomato edited lines defective in individual GGPPS or PSY isoforms to generate double mutant combinations. The main objective was to understand what GGPPS-PSY pairs regulated the channeling of isoprenoid precursors into the carotenoid pathway in different organs of the tomato plant, including leaves, flowers and fruits (as the SlG1-PSY3 tandem had been previously shown to be involved in SL production in roots). The generation and analysis of double mutants revealed a major role for SlG3 in providing GGPP to PSY2 for carotenoid production in the leaf, while SlG2 and PSY1 appeared to be most relevant in flower and fruit tissues.

In the second chapter of the thesis, we aimed at editing the tomato gene encoding HY5, a transcription factor shown to activate carotenoid biosynthesis in many plant systems. HY5 is accumulated in the light but degraded in the dark or in the shade via interaction with the E3 ubiquitin ligase COP1. To increase HY5 activity, we generated tomato lines with a truncated version of HY5 that is unable to interact with COP1. The resulting HY5 gain-of-function lines (referred to as slhy5-D lines) exhibited shorter hypocotyls, epicotyls and higher leaf anthocyanin content compared to their respective backgrounds, whereas Western blot analysis confirmed increased stability and abundance of the mutant HY5 protein in different light conditions. Strikingly, slhy5-D lines did not show substantially increased levels of carotenoids in leaves or fruits. We further investigated the phenotype of slhy5-D lines considering that increased HY5 activity might result in shade tolerance. The presence of neighboring plants results in a decreased ratio of red to far-red light (low R:FR) resulting from the preferential use of R for photosynthesis and the reflection or filtering of FR. Shade associated to vegetation proximity can be simulated in the lab by enriching white light (W, high R:FR) with FR (W+FR, low R:FR). All tomato accessions analyzed were found to elongate and reduce their photosynthetic pigment levels (including carotenoids) in response to W+FR illumination compared to W-exposed controls. When exposed to W+FR, slhy5-D lines displayed partial shade tolerance compared to their unedited parental lines, as deduced from attenuated plant elongation. However, no effects were observed in carotenoid levels.

Finally, in the last chapter of the thesis, we investigated whether alterations in other molecular components resulting in shade tolerance could prevent the degradation of carotenoids associated to low R:FR signaling. Specifically, we carried out an untargeted approach to look for shade-tolerant mutants in collections of tomato landraces and introgression lines (ILs). As a result, we identified an introgression line (IL2-2) as tolerant to W+FR conditions in terms of elongation. In this line, photosynthetic carotenoid levels did not decrease under W+FR compared to W at the seedling stage, but the phenotype was not preserved in adult plants. This line exhibited altered auxin homeostasis and reduced expression of auxin-responsive genes under simulated proximity shade. Notably, IL2-2 also showed improved yield performance under high-density planting conditions in open-field trials.

[cat] Els carotenoides són isoprenoides essencials en les plantes, principalment necessaris per a la fotoprotecció. No obstant això, les seves funcions varien segons l'espècie vegetal i l'òrgan, actuant com a pigments en moltes flors i fruits, i com a precursors d’hormones com l’àcid abscísic (ABA) i les estrigolactones (SLs) en altres teixits. En humans, els carotenoides dietètics són una font important de compostos antioxidants i vitamina A. Per tant, la biofortificació amb carotenoides és una estratègia clau per millorar la seguretat alimentària i la nutrició. Els carotenoides estan presents a nivells relativament elevats en el fruit d’espècies agrícolament importants com el tomàquet (Solanum lycopersicum L.). No obstant això, el nostre coneixement sobre com es canalitzen els precursors isoprenoides cap a la via dels carotenoides en els fruits i altres òrgans d’aquest cultiu és encara molt limitat. La fitoè sintasa (PSY) és un enzim clau que produeix fitoè (el primer intermediari en la via dels carotenoides) a partir de pirofosfat de geranilgeranil (GGPP). En el pas anterior, les sintases de GGPP (GGPPS) sintetitzen GGPP a partir dels precursors isoprenoides universals pirofosfat d’isopentenil i pirofosfat de dimetilalil. El tomàquet té tres gens que codifiquen isoformes de GGPPS (anomenats aquí SlG1, SlG2 i SlG3) i PSY (PSY1, PSY2 i PSY3). En la primera part d’aquesta tesi, es van utilitzar línies de tomàquet editades prèviament, defectuoses en isoformes individuals de GGPPS o PSY, per generar combinacions de dobles mutants. L’objectiu principal era entendre quines parelles GGPPS-PSY regulaven la canalització dels precursors isoprenoides cap a la via dels carotenoides en diferents òrgans de la planta de tomàquet, incloent-hi les fulles, les flors i els fruits (ja que s’havia demostrat prèviament que el tàndem SlG1-PSY3 participava en la producció de SL a les arrels). La generació i anàlisi de dobles mutants va revelar un paper principal de SlG3 en el subministrament de GGPP a PSY2 per a la producció de carotenoides en les fulles, mentre que SlG2 i PSY1 semblaven ser més rellevants en teixits florals i de fruit. En el segon capítol de la tesi, ens vam proposar editar el gen del tomàquet que codifica HY5, un factor de transcripció que s’ha demostrat que activa la biosíntesi de carotenoides en molts sistemes vegetals. HY5 s’acumula a la llum però es degrada a la foscor o a l’ombra mitjançant la interacció amb la ubiquitina ligasa E3 COP1. Per augmentar l’activitat de HY5, es van generar línies de tomàquet amb una versió truncada de HY5 que és incapaç d’interaccionar amb COP1. Les línies resultants amb guany de funció de HY5 (anomenades línies slhy5-D) mostraven hipocòtils i epicòtils més curts i un contingut més alt d’anocianines a les fulles en comparació amb les línies de fons respectives, mentre que l’anàlisi per Western blot va confirmar una estabilitat i abundància majors de la proteïna HY5 mutada en diferents condicions de llum. Sorprenentment, les línies slhy5-D no mostraven nivells substancialment augmentats de carotenoides en fulles o fruits. Es va investigar més a fons el fenotip d’aquestes línies, considerant que l’augment d’activitat de HY5 podria traduir-se en tolerància a l’ombra. La presència de plantes veïnes provoca una disminució en la relació entre llum vermella i vermella llunyana (baix R:FR) a causa de l’ús preferencial de R per a la fotosíntesi i la reflexió o filtratge de FR. L’ombra associada a la proximitat vegetal es pot simular al laboratori enriquint la llum blanca (W, alt R:FR) amb FR (W+FR, baix R:FR). Totes les accessions de tomàquet analitzades van mostrar elongació i una reducció en els pigments fotosintètics (inclosos els carotenoides) en resposta a W+FR en comparació amb els controls exposats a W. Quan es van exposar a W+FR, les línies slhy5-D van mostrar una tolerància parcial a l’ombra respecte a les seves línies parentals no editades, tal com es dedueix de l’atenuació de l’elongació de la planta. No obstant això, no es van observar efectes en els nivells de carotenoides. Finalment, en l’últim capítol de la tesi, es va investigar si alteracions en altres components moleculars que resultin en tolerància a l’ombra podrien evitar la degradació dels carotenoides associada al senyal de baix R:FR. Concretament, es va dur a terme un enfocament no dirigit per identificar mutants tolerants a l’ombra en col·leccions de varietats tradicionals i línies d’introgresió (ILs) de tomàquet. Com a resultat, es va identificar una línia d’introgresió (IL2-2) com a tolerant a les condicions W+FR pel que fa a l’elongació. En aquesta línia, els nivells de carotenoides fotosintètics no van disminuir sota W+FR en comparació amb W en fase de plàntula, però el fenotip no es va mantenir en plantes adultes. Aquesta línia mostrava una homeòstasi alterada de les auxines i una expressió reduïda de gens sensibles a l’auxina sota ombra simulada per proximitat. Notablement, IL2-2 també mostrava un rendiment agronòmic millorat en condicions de plantació d’alta densitat en assajos de camp obert.