Caracterització proteòmica de l'espermatozoide humà. Proteïnes diferencials trobades en pacients astenozoospèrmics

Abstract

[cat] La infertilitat és una malaltia que afecta a un 15% de les parelles en edat reproductiva. En la meitat dels casos, el problema té un origen masculí. Però, tot i els avenços existents en la fisiologia de la reproducció, encara hi han un 10% de parelles amb una infertilitat d'origen desconegut. Així, aprofitant les noves tecnologies existents tal com la proteòmica (gels 2D, anàlisis per MS/MS, etc.) es va decidir realitzar un estudi de l'espermatozoide humà per tal d'aprofundir en el coneixement de les proteïnes implicades en la fertilització. Primer, es va realitzar un estudi per descriure part del proteoma de l'espermatozoide humà. Es van descriure 98 proteïnes, localitzant-les en un mapa 2D. Un 22% d'aquestes proteïnes es van descriure per primera vegada com a presents en l'espermatozoide humà. D'un 11% no se'n coneix la funció, mentre que un 23% tenen una funció relacionada amb la transcripció, la síntesi proteica o l'intercanvi proteic. Aquesta dada és sorprenent ja que, fins fa poc, es creia que l'únic objectiu de l'espermatozoide era portar el material genètic masculí fins l'oòcit femení. La resta de proteïnes tenen una funció que s'engloba dintre d'aquestes categories: 23% relacionades amb la producció d'energia; 11% relacionades amb el cicle cel·lular, l'apoptosis i l'estrès oxidatiu; 10% relacionades amb el citoesquelet, el flagel i el moviment cel·lular; 9% relacionades amb la transducció de senyal; 7% relacionades amb el reconeixement cel·lular; i, per últim, un 6% té una funció relacionada amb el metabolisme. D'aquestes 98 proteïnes (amb 3 proteïnes noves d'un altre estudi realitzat al laboratori), es va fer un estudi comparant la seva abundància relativa entre pacients astenozoospèrmics i controls (donants de semen). D'aquesta comparació, es van trobar 17 proteïnes amb una abundància relativa diferent entre pacients i donants. Aquestes proteïnes són ACTB, ANXA5, COX6B, H2A, PIP i el seu precursor,i dos punts corresponents a S100A9; totes aquestes es troben disminuïdes en els pacients. La resta de proteïnes son la forma precursora de CLU, DLD, FH, SEMG1, a més d'HSPA2, IMPA1, PSMB3, TEX12 i un punt que conté dos proteïnes: MPST i la forma precursora d'ECH1. Totes aquestes proteïnes es troben augmentades en pacients. La majoria d'aquestes proteïnes es poden agrupar en tres grans grups: proteïnes relacionades amb la producció d'energia (COX6B, DLDpre, FHpre i ECH1pre), amb l'estructura i el moviment (ACTB, PIP i PIPpre, H2A i SEMG1), i senyalització cel·lular i regulació ( ANXA5, S100A9 i IMPA1). A més, es va realitzar un estudi paral·lel estudiant les mateixes 101 proteïnes, però amb pacients normozoospèrmics (sense cap causa aparent d'infertilitat) i donants de semen de fertilitat probada. Donat el caràcter tan exclusiu de les mostres, nomès es van poder comparar sis pacients versus 5 donants. Tot i això, es van trobar dos proteïnes amb diferències a la seva abundància relativa. Aquestes proteïnes són la PDIA3 i la TEX12. Aquestes dades, però, no es poden considerar com a definitives, ja que el valor obtingut per a aquestes mostres de p (p<0.001) ens indica que un de cada 100 resultats pot ser degut a l'atzar. Així, una d'aquestes proteïnes pot ser un fals possitiu. Amb aquests valors quantitatius, es va realitzar una agrupació no dirigida per tal de veure si aquestes proteïnes ens agrupaven les mostres segons el seu fenotip. Per a la comparació "astenozoospèrmics vs donants", l'agrupació va ser possitiva; en una branca de l'arbre resultant, teníem tots els pacients i, a l'altra, tots els donants. Per últim, es va posar a punt la metodologia DIGE en mostres d'espermatozoides humans. Tot i que es necessitaran més dades per a acabar d'ajustar el procediment, els primers resultats són encoratjadors.

[eng] Infertility is a disease that affects 15% of couples at reproductive age. In about a half, the problem has a male origin. Conventional 1-DE has in the past provided a wealth of information concerning the major sperm proteins. However, so far there are relatively few reports exploiting the potential of the present proteomic tools to identify and to study additional yet-unidentified important proteins present in human spermatozoa. In this work, 2-DE of proteins from spermatozoa led to the identification of 98 different proteins. The function of these proteins turned out to be energy production (23%), transcription, protein synthesis, transport, folding and turnover (23%), cell cycle, apoptosis and oxidative stress (10%), signal transduction (8%), cytoskeleton, flagella and cell movement (10%), cell recognition (7%), metabolism (6%) and unknown function (11%). As many as 23% of the proteins identified have not been previously described as being expressed in human spermatozoa. Also, asthenozoospermia is one of the most common findings present in infertile males, but its aetiology remains unknown in most cases. Present proteomic tools now offer the opportunity to identify proteins which are differentially expressed in asthenozoospermic semen samples and potentially involved in infertility. In this work, we compared the expression of 101 sperm protein spots in 20 asthenozoospermic samples to that of 10 semen donor controls using two-dimensional proteomic analysis. This results in seventeen protein spots, that have been identified at different amounts in the asthenozoospermic samples compared with controls. These are cytoskeletal actin-B, annexin-A5, cytochrome C oxidase-6B, histone H2A, prolactin-inducible protein and precursor, calcium binding protein-S100A9 (2 spots), clusterin precursor, dihydrolipoamide dehydrogenase precursor, fumarate hydratase precursor, heat shock protein-HSPA2, inositol-1 monophosphatase, 3-mercapto-pyruvate sulfurtransferase/dienoyl-CoA isomerase precursor, proteasome subunit-PSMB3, semenogelin 1 precursor and testis expressed sequence 12. The detected amount of these proteins enabled the grouping of asthenozoospermic sperm samples in an unsupervised clustering analysis. So, in conclusion, we have identified several proteins present at different amount in asthenozoospermic sperm samples. These proteins could be candidates towards the development of diagnostic markers, and open up the opportunity to gain further insight into the pathogenic mechanisms involved in asthenozoospermia.