Interfaces proteína-proteína: un nuevo tipo de diana terapéutica

Abstract

[spa] En esta tesis se presentan las Interfaces Proteína-­Proteína como un Nuevo Tipo de Diana Terapéutica a explotar, a través del estudio de un sistema de dos proteínas implicado en la quimiotaxis bacteriana: CheA/CheY. En la segunda parte de la tesis, presentamos la regulación alostérica por fosforilación en HDAC8, a través de esta proteína poco conocida todavía, queremos vislumbrar el método de propagación que sigue a la entrada del fosfato en el lugar alostérico, y cómo en última instancia esto genera la inhibición de la función desacetilasa de la proteína. Para la primera parte de la tesis, primeramente, se elige un sistema tipo de dos proteínas, en base a un cribado inicial del PDB en busca de cavidades capaces de unir moléculas pequeñas tipo fármaco, que reúnan una serie de características, y posterior caracterización de la cavidad a estudiar. Tras estre cribado, se eligió el sistema CheA/CheY como sistema tipo. Paralelamente, otros miembros del grupo, seleccionaron compuestos comerciales capaces de unirse a la interfaz, mediante programas de docking como rDock, a fin de seleccionar compuestos con posible acción estabilizadora del complejo (compuestos con acción PP-­‐glue). Más adelante, también se adquirieron 4 fragmentos derivados de la benzen-­‐sulfonamida. La afinidad del complejo y cómo los compuestos le afectaban, fue estudiado: mediante técnicas biofísicas, como SPR y Termoforesis. Mediante la primera técnica, caracterizamos la afinidad del complejo y ensayamos los más de 100 compuestos que se adquirieron, en busca de compuestos activadores, que actuasen como PP-­‐ glue. Una vez encontrados, estos se estudiaron más a fondo mediante Termoforesis a fin de saber cuál es la afinidad de cada uno de ellos por cada una de las proteínas del sistema, cómo afecta a la Kd del complejo la adición de estos, y si esta es dependiente de la concentración. Una vez seleccionados los compuestos activadores, se quiso comprobar mediante cristalografía que el luegar de unión de estos era el predicho mediante técnicas computacionales. Para ello, primeramente se obtuvo la estructura cristal del sistema de dos proteínas a 2,5Å. Posteriormente, se buscó obtener la estructura cristal del mismo complejo, esta vez en presencia de los compuestos activadores y fragmentos, mediante co-cristalización y soaks. También realizamos una serie de experimentos in vivo, aprovechando la implicación del sistema en la quimiotaxis bacteriana y que la alteración del mismo puede traducirse en un cambio en la motilidad bacteriana, apreciable macroscópicamente. Para ello, realizamos una batería de cultivos en agar motil, en presencia de atractantes, repelentes, dichos compuestos, y observamos la distancia recorrida en cada uno de los casos. Para la segunda parte de la tesis y el estudio del alosterismo en HDAC8, realizamos una serie de mutaciones estratégicas, determinadas mediante dinámicas moleculares previas, realizadas por miembros del grupo, y observamos mediante Western Blot, cómo afectan estas mutaciones al nivel de fosforilación final de la proteína, y mediante ensayos in vitro observamos su correlación con la actividad desacetilasa final de cada uno de los mutantes.